附表1大学生科技创新基金研究项目进度表

大学生科技创新基金研究项目进度表

项目名称 从白云鄂博地区的土壤中筛选具有解钾功能的细菌 项目 分类 自然科学 姓名 (项目负责人) 袁浩容 所在学院 (班级) 数理与生物工程学院 生物技术2011 指导教师 (签字) 批准资助 金额 3800元 项目 类型 李保卫大学生科技创新基金项目 实际 2130元 支出 一、研究工作主要进展、阶段性成果及经费使用情况（可附复印件） ㈠本组成员从白云鄂博地区采集矿区附近表层土壤和矿层土壤，保存于无菌塑料袋中运回实验室，于4℃冰箱保存备用。 土壤样品 ㈡本组成员利用手持X摄像荧光光谱仪探测白云鄂博矿区富钾板岩矿石，取回K2O含量大于8%的富钾板岩矿石，粉碎至200目（可以一定程度上破坏矿石的晶格，有利于解钾微生物分解矿石）备用。 富钾板岩矿石 200目富钾板岩矿粉 ㈢富钾板岩成份分析： ⑴网上资料： 为综合利用白云鄂博资源，相关单位曾于1979年3月始为期1年对主东矿矿体采剥范围内的板岩进行了地质勘查与评价，并进行了物质成份研究和矿石加工试验，参考以上工业要 求求得富钾板岩2.9亿吨，K20平均品位10.94%(其中富矿1.6亿吨，K20平均品位12.14%，占55%以上)，根据我国对含钾岩石矿床规模(大型>100万吨)的划分，该矿床同该区的稀土铁矿一样，已达到特大型水平，是我国特大型钾矿资源基地之一。 ⑵手持X摄像荧光光谱仪检测： ㈣菌种筛选以及解钾功能验证： ⑴配置培养基（采用通用培养基）： 富集培养基: 葡萄糖 10.0 g，KH2PO4 0.2g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.2 g, CaSO4·2H2O 0.2 g, ，CaCO3 5.0 g，无氮琼脂 15.0 g, 去离子水 1 000 mL，pH 7． 2。 筛选培养基: 葡萄糖 10.0 g，Na2HPO4 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.2 g, CaSO4·2H2O 0.2 g, ，CaCO3 5.0 g，琼脂 15.0 g, 低品位稀土矿石粉（200目）5.0g，去离子水 1 000 mL，pH 7． 2。 发酵培养基: 葡萄糖 10.0 g，Na2HPO4 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.2 g, CaSO4·2H2O 0.2 g, ，CaCO3 5.0 g, 低品位稀土矿石粉（200目，矿粉也是经过盐酸浸泡48小时处理得到的，这样保证 去除了矿粉中可溶行钾、硫、磷。）5.0g，去离子水 1 000 mL，pH 7． 2。 ⑵土壤悬浮液配置：称取10.0g土壤样品，加入100ml去无菌水。用磁力搅拌器充分混匀制成悬液，然后梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。 ⑶菌种筛选以及分离纯化： 取稀释液0.2 mL 涂布于富集培养基平板，28 ℃培养 3 ～4 d，待细菌菌落长出后进行四分体划线纯化。将纯化至第四代的细菌接种于筛选培养基，28 ℃培养3 d后。 部分细菌图片 ⑷解钾功能验证： ①制作菌种母液 挑取各单菌落分别接种于液体培养基（葡萄糖 10.0 g，Na2HPO4 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.2g, NaCl 0.2 g, CaSO4·2H2O 0.2 g, ，CaCO3 5.0 g,去离子水 1 000 mL，pH 7． 2）。28 ℃200 rpm/min摇床培养3 d后。 ②微生物浸矿 按菌种母液与发酵培养基体积比1:100分别将各菌种母接种于发酵培养基中，30℃，200 rpm/min摇床培养20 d。 部分细菌浸矿 ③微生物解钾率测定：将浸矿液体常法灭菌（目的破碎微生物结构，释放可溶性钾），灭菌后的浸矿液体过滤，用四苯硼钠滴定法测滤液中可溶性钾。发现四苯硼钠滴定法灵敏度太低检测不出可溶性钾，改用原子火焰吸收光谱法检测浸矿液可溶性钾含量。原子火焰吸收光谱法检测浸矿液中可溶性钾含量原理为：原子吸收是指呈气态的原子对由同类原子辐射出的特征谱线所具有的吸收现象。在一定频率的外部辐射光能激发下，原子的外层电子由一个较低能态跃迁到一个较高能态，此过程产生的光谱就是原子吸收光谱。 部分结果如下： 浸矿液可溶性钾含量表 菌种标号 钾含量（mg/L） B2① 13.15 B3② 6.78 B3④ 6.7 B4③ 4.69 B5① 6.84 B5③ 6.49 B6① 6.76 B6② 9.2 空白 4.53 火焰原子吸收分光光度计 ⑸各菌种解钾率： 解钾率=（浸矿液可溶性钾总含量-空白对照组液体可溶钾含量）*100% / 矿粉含钾总量 部分菌种解钾率 菌种标号 B2① B3② B5① B5③ B6① B6② 解钾率 1.3% 0.33% 0.35% 0.29% 0.34% 0.70% ㈤菌种鉴定： ⑴收集菌体：①将菌种母液收集于50ml离心管中，4℃，4000r/min离心10分钟，去除上清液。 ②用PBS缓冲液液冲洗浓缩菌体。 ③4℃，1000r/min离心5分钟。作用是去除杂质。将步骤①-③反复操作三次。 ④将菌种收集于10ml离心管。 ⑵菌体总DNA提取：各取2mL菌液，加入10mg/mL，400uL溶菌酶，37℃水浴2h后转入新离心管，每管加入蛋白酶K（20mg/mL）30uL，50uLSDS溶液（20％）和40uL 5mol/LNaCl，53℃水浴2h后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提，9000r/min 离心5min。取上清至新离心管加入2/3体积的氯仿：异戊醇（24:1），9000r/min离心取上清，加入0.6倍异戊醇4℃过夜沉淀，12000r/min离心10min，弃上清，加入70％预冷乙醇清洗两遍，自然风干，加50mLTE缓冲液，-20℃保存。将提取的各菌种总DNA进行琼脂糖凝胶电泳验证，提取效果不理想。 ⑶PCR扩增16sr RNA全长片段： 扩增16S rRNA基因部分的序列，PCR扩增引物为正向引物为27BF(5，-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，)； 反向引物为1492BR (5，-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3，)PCR反应体系16S rRNA-PCR反应体系 (50 μl) 试剂 2Taq MasterMix（康为世纪：Cat. No. CW0690） 27BF (10 uM) 2 μl 1492BR (10 uM） 2 μl Template DNA 2 μl RNase-Free Water 19 μl PCR反应条件:预变性94℃2 min变性94℃30 s退火56℃30 s延伸72℃30 s终延伸72℃10 min 30个循环 0.4 uM 0.4 uM 50 μl反应体系 25 μl 终浓度 1 菌落PCR部分结果（1-7为本实验组菌落PCR结果） ⑤将PCR结果中1、5、6、7所对应的菌种16S rRNA送往上海生工生物工程有限公司测序。 ⑥结果：将测序结果与NCBI数据库进行比对 PCR结果中1、6、7所对应菌种为假单孢菌属 PCR结果中5所对应菌种为肠杆菌属 NCBI数据库比对结果 ㈥购买巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，AS1.459;GIMCC GIM1.14)和胶质芽孢杆菌（Bacillus munilaginosus, AS1.231;GIMCC GIM1.15）并验证其解钾功能： ⑴从北京北纳创联生物技术研究院购买巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌 左为胶质芽孢杆菌，右为巨大芽孢杆菌 ⑵购买菌种进行浸矿实验： ①菌种母液制备：胶质芽孢杆菌（Bacillus munilaginosus, AS1.231;GIMCC GIM1.15）在固体培养基（培养基组成：KH2PO4 0.2g、K2HPO4 0.8g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaSO4·2H2O 0.1 g、NaMO4·2H2O 微量、酵母膏 0.5g、甘露醇20g、FeCl3 微量、琼脂 15g、蒸馏水1L,pH值7.2）中，30℃恒温培养箱中活化2-3天，然后转入发酵培养基（培养基组成：蔗糖10 g、酵母膏0.5 g、(NH4)2SO4 0.5 g、MgSO4 0.1 g、KCl 0.1 g、Na2HPO4 0.1 g、CaCO3 1.0 g、蒸馏水1L，pH值6.8~7.2）中，30℃，200 rpm/min摇床培养5-6天，得到胶质芽孢杆菌菌液。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium，AS1.459;GIMCC GIM1.14)在固体培养基（培养基组成：蛋白胨 5 g、牛肉膏 3 g、 NaCl 5 g、琼脂 20 g、蒸馏水1L，pH值7.0~7.2）中，30℃恒温培养箱中活化2-3天，然后转入发酵培养基（培养基组成：葡萄糖 10 g、(NH4)2SO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、 NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)2 5 g、蒸馏水1L；pH值7.0~7.3）中，30℃，200 rpm/min摇床培养5-6天，得到巨大芽孢杆菌菌液。 ②浸矿实验：按胶质芽孢杆菌菌种母液与液体浸矿培养基（蔗糖10 g、酵母膏0.5 g、(NH4)2SO4 0.5 g、MgSO4 0.1 g、KCl 0.1 g、Na2HPO4 0.1 g、CaCO3 1.0 g、200目富钾板岩矿粉 5 g，蒸馏水1L，pH值6.8~7.2）体积比1:100，将胶质芽孢杆菌菌种母液接种于液体浸矿培养基，30℃，200 rpm/min摇床培养20天。按巨大芽孢杆菌菌种母液与液体浸矿培养基蛋白胨 5 g、牛肉膏 3 g、 NaCl 5 g、琼脂 20 g、200目富钾板岩矿粉 5 g，蒸馏水1L，pH值7.0~7.2）体积比1:100，将巨大芽孢杆菌菌种母液接种于液体浸矿培养基，30℃，200 rpm/min摇床培养20天。摇床培养结束后将浸矿液体经常法灭菌、过滤。 ③解钾功能验证： 将②中所得滤液用火焰原子吸收法测定可溶性钾含量，结果如下： 菌种解钾效果 菌种名 钾含量（mg/L) 解钾率 经费使用情况： ㈠车费400元。 ㈡购买实验药品及器材200元。 ㈢购买菌种1530元。 巨大芽孢杆菌 98.9 29.7% 胶质芽孢杆菌 48.8 11.8 合计2130元。 二、存在问题、建议及需要说明的情况 1.本实验组筛选出来的菌种解钾效率比较低，指导教师建议购买解钾效率高的菌种。 2.四苯硼钠滴定法测定溶液中可溶性钾含量灵敏度太低，改用火焰原子吸收法测定。 三、所在单位自查意见 主管领导（签字）： （单位公章） 年 月 日 四、大学生科技创新领导小组审核意见 1． 计划完成情况 □按原计划完成任务 □基本按原计划完成任务 □未完成原计划任务 2． 经费拨款情况 □按计划拨款 □暂缓拨款 其他 负责人（签字）： （单位公章） 年 月 日