中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志・２０１４年９月第７卷第３期 ２５０・ ＣＨＩＮ Ｊ ＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳ＆ＢＯＮＥ ＭＩＮＥＲ ＲＥＳ Ｖｏ１．７ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０．２０１４ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—２５９１．２０１４．０３．０１ １ ・基础研究・ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路在骨髓间充质干细胞增殖 及成骨分化调控中的作用 王雪鹏，李茂强，边振宇，季成，何齐芳，姚旺祥，朱六龙 ［摘要］ 目的研究ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路抑制剂ＬＹ２９４００２对骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ＭＳＣｓ）增殖及分化的影响。方法 采用贴壁法体外分离人骨髓问充质干细胞（ｈＭＳＣｓ），加入ＰＩ３Ｋ抑制剂 ＬＹ２９４００２（１、１０ ｉｘｍｏｌ／Ｌ），应用ＭＴｒ法测定细胞增殖，常规成骨诱导分化培养３或７ ｄ，采用碱性磷酸酶 （ＡＬＰ）染色观察成骨分化水平，化学比色法测定ＡＬＰ活性，茜素红染色后观察矿化钙结节数量并定量分析， Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测磷酸化Ａｋｔ蛋白表达，应用Ｒｅａｌｔｉｍｅ—ＰＣＲ检测各组细胞ＢＭＰ２、Ｒｕｎｘ２、ＯＰＮ及Ｏｓｔｅｒｉｘ等成骨 分化标记物的基因表达水平。结果 从２４至７２ ｈ，ＬＹ２９４００２对ｈＭＳＣｓ增殖均产生显著抑制，随时间推延， 可见抑制增殖效果增强（Ｐ＜０．０５）。ＡＬＰ染色和定量测定提示１０ ｐ．ｍｏｌ／Ｌ的ＡＬＰ活性最强，在不同时间显著 高于对照组和１ ｉｘｍｏｌ／Ｌ组（Ｐ＜０．０５）。成骨诱导培养３和７ ｄ，１、１０ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ组矿化量都显著高于对照组 （Ｐ＜０．０５）。１０￣ｍｏｌ／Ｌ组矿化量在成骨诱导７ ｄ也显著高于１ １ Ｌ组（Ｐ＜０．０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测结果 证实成骨诱导可激活Ａｋｔ磷酸化蛋白表达，但ＬＹ２９４００２可抑制该蛋白磷酸化。成骨诱导分化７ ｄ，ｌ、 １０ ｍｏＬ／Ｌ均明显促进ＢＭＰ２、Ｒｕｎｘ２、ＯＰＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ ４种基因ｍＲＮＡ表达（均Ｐ＜０．０５）。结论时促进其向成骨分化和矿化。 ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信 号通路参与ｈＭＳＣｓ增殖和分化过程。成骨分化伴随下游Ａｋｔ蛋白表达。ＰＩ３Ｋ抑制剂可抑制ｈＭＳＣｓ增殖，但同 ［关键词］ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路；骨髓间充质干细胞；细胞增殖；成骨分化 文献标志码：Ａ 中图分类号：Ｒ６８１ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＷＡＮＧＸｕｅ－ｐｅｎｇ，ＬＩＭａｏ—ｑｉａｎｇ，ＢＩＡＮＺｈｅｎ—ｙｕ，ｊＩ Ｃｈｅｎｇ，ＨＥ Ｑｉ扣ｎｇ，ＹＡＯ Ｗａｎｇ－ｘｉａｎｇ．ＺＨＵＬｉｕ—ｌｏｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１０００６，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ＬＹ２９４００２，ａ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒ— ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ｈＭＳＣｓ） ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ．ｈＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＬＹ２９４００２，ｔｈｅ ＰＩ３ Ｋ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｔ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，１￣ｍｏｌ／Ｌ ｏｒ １０ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＭＴＦ ａｓｓａｙ．Ａｆｔｅｒ ３ ｄａｙｓ ｏｒ ７ ｄａｙｓ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ．Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｆｏｒ Ａｋｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ＢＭＰ２，Ｒｕｎｘ２，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ａｎｄ Ｏｓｔｅｒｉｘ，ｗｅｒｅ ｄｅ一 基金项目：卫生部医药卫生科技发展中心医学科研专项课题（Ｗ２０１３ＺＴ２０５）；浙江省卫生厅一般项目 （０２０１２ＫＹＡ１４６）；杭州市卫生局重点项目（２０１２Ｚ００３） 作者单位：３１０００６杭州，杭州市第一人民医院骨科南京医科大学附属杭州医院骨科 通信作者：朱六龙，Ｅ—ｍａｒｌ：ｚｈｕｌｉｕｌｏｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志２０１４年９月第７卷第３期 ＣＨＩＮ Ｊ ＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳ＆ＢＯＮＥ ＭＩＮＥＲ ＲＥＳ Ｖｏ１．７ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０．２０１４ ｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｒｅａｈｉｍｅ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｎｏｎ—ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ２４ ｈｏｕｒｓ ｔｏ ７２ ｈｏｕｒｓ，ＬＹ２９４００２ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｆｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｈＭＳＣｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｓ ｔｉｍｅ ｗｅｎｔ ｂｙ（Ｐ＜０．０５）．１０ ｔｘｍｏｌ／Ｌ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ＡＬＰ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ １￣ｍｏｌ／Ｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ＡＬＰ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ａｔ ３ ｄａｙｓ ｏｒ ７ ｄａｙｓ ｏｓｔｅｏ— ｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｓｉｍｉｌａｒｌｙ，１ ｉ￣ｍｏｌｆＬ ａｎｄ １０ ｐ．ｍｏｌ／Ｌ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｃａｌｃｉｉｆｅｄ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ３ ｄａｙｓ ｏｒ ７ ｄａｙｓ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ａｔ ７ ｄａｙｓ，１０ ｔｘｍｏｌ／Ｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｍｏｒｅ ｃａｌｃｉｉｆｅｄ ｍｉｎｅｒａｌｓ ｔｈａｔ １ ｔｚｍｏｌ／Ｌ（Ｐ＜０．０５）．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ＬＹ２９４００２．Ａｔ ７ ｄａｙｓ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｅｉｔｈｅｒ １ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ ｏｒ １０ Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＢＭＰ２，Ｒｕｎｘ２，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ａｎｄ Ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｐ＜０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈＭＳＣｓ．Ｄｕｒ・ ｉｎｇ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３ Ｋ／Ａｋｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ Ａｋｔ．ＬＹ２９４００２ ａｒｒｅｓｔｓ ｈＭＳＣｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ｐｒｏｍｏｔｓ ｔｈｅｉｒ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ；ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ 骨质疏松症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，ＯＰ）是一种以低骨 ｒａ，日本），ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６ 量、骨微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和容易 等荧光抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，美国），兔抗人ｐ－Ａｋｔ ３０８）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，美国）， 骨折的全身性疾病。骨质疏松症致病与骨髓间充质 （Ｔｈｒ干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｉｌｓ，ＭＳＣｓ）生物学行 ＨＲＰ标记羊抗兔ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，美国）， 为有关＿１ Ｊ。骨质疏松症患者常表现为ＭＳＣｓ增殖和 硝酸纤维素膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，美国），垂直电泳仪 自我更新能力降低，凋亡数量增加，成骨分化减 （Ｂｉｏ．Ｒａｄ，美国），紫外分光光度计（ＮａｎｏＤｒｏｐ 弱，成脂分化增强以及多向分化调节紊乱 ４ 。 ＮＤ一１００，美国），酶标仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ５５０，美国）， ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路广泛存在于真核动物细胞中， ＰＣＲ扩增仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，德国），实时定量ＰＣＲ仪 参与多种细胞增殖、凋亡、分化调节 Ｊ。近期研 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００，美国），倒置相差显微 究发现，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号可促进前体成骨细胞系 镜（ＯＬＹＭＰＵＳ，日本）。人骨髓间充质干细胞的分离培养 经杭州市第一人民医院伦理委员会同意，并在 ＭＣ３Ｔ３一Ｅ１增殖、分化 ，并可诱导不依赖于 ＲＡＮＫＬ的破骨细胞分化 Ｊ。但关于ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号 通路是否参与ＭＳＣｓ早期定向分化调节目前缺乏直 患者知情同意的前提下，取人工髋关节置换术中扩 接实验证据。本研究采用ＰＩ３Ｋ特异性抑制剂 髓液。利用贴壁法分离人骨髓间充质干细胞（ｈＭ—ＬＹ２９４００２阻断ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路传导，探索该信 ＳＣｓ），以无菌新鲜扩髓液１０ ｍＬ，加入４０ ｍＬ含 ｘｇ／ｍＬ链 号对ＭＳＣｓ增殖和成骨分化的影响，证实该信号通 １０％胎牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ青霉素Ｇ、１００ ｔ路在骨质疏松症致病过程中的潜在作用机制。 霉素的仅．ＭＥＭ培养基，混匀制成单细胞悬液，分别 接种于５个１０ ｃｍ培养皿。在３７ ｃＩＣ ５％ＣＯ２培养箱 材料与方法 细胞来源及主要试剂和仪器 内进行培养，至第３天初次半换液，此后每３ ｄ换 液至细胞８０％融合，胰酉每／ＥＤＴＡ消化，加入抗 ０５和ＣＤ１６６等单克隆抗 ＬＹ２９４００２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，美国）， ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１ 磷酸抗坏血酸、Ｂ．甘油磷酸钠、地塞米松、Ｍｒ丌、 体，经流式细胞仪分析鉴定，传代至第３代备用。细胞增殖实验 ＤＭＳＯ、ｐ－ＮＰＰ、茜素红（Ｓｉｇｍａ，美国）， —ＭＥＭ 培养基、胎牛血清、青霉素／链霉素、胰酶／ＥＤＴＡ 按１×１０ ／ｍＬ的细胞浓度，将处于对数生长期 ００ ＩｘＬ。分 （Ｈｙｃｌｏｎｅ，美国），１０ ａｍ培养皿、６孔板、９６孔 的第３代ｈＭＳＣｓ接种于９６孔板，每孔２￣ｍｏＬ／Ｌ的ＬＹ２９４００２，每孑Ｌ４ 板（Ｃｏｒｎｉｎｇ，美国），ＡＬＰ染色试剂盒（南京建 别加入浓度为１和１０ ｉ成，中国），Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国），反转录酶 个复孔重复，以加人ＤＭＳＯ为阴性对照组 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎ— （ＣＮＴ），另以未加入细胞、只含基础培养基为空白 Ｉ＝５％ＣＯ：培养箱内，分别培养 ｔａｓ，加拿大），聚合酶ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａ． 对照组，置３７ ｃ中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志２０１４年９月第７卷第３期 ＣＨＩＮ Ｊ ＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳ＆ＢＯＮＥ ＭＩＮＥＲ ＲＥＳ Ｖｏ１．７ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０，２０１４ １２、２４、４８和７２ ｈ。每孔加人２０ Ｌ Ｍ１＿ｒ溶液 ＯＤ值。（５ ｍｇ／ｍＬ），３７℃孵育４ ｈ，出现紫色针状结晶， Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 弃上清后加人１００ Ｌ ＤＭＳＯ，置于３７℃恒温摇床 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测磷酸化Ａｋｔ蛋白表达：提取 上振荡２０ ｍｉｎ。待紫色结晶溶解完全，以空白对照 ｈＭＳＣｓ总蛋白，蛋白酶抑制剂防止其降解，ＢＣＡ 孔吸光度值（ＯＤ）调零，用酶标仪在波长４９０ ｎｍ 法测定蛋白质浓度，配置浓缩胶和分离胶，取 处读取ＯＤ值。根据下面公式计算细胞增殖率： ５０ｔｘｇ样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常规转膜， （ＯＤ ｄ／ＯＤ… ｌ一１）Ｘ １００％。 成骨诱导培养 取第３代ｈＭＳＣｓ，以５×１０ ／ｍＬ的密度接种于 ６孔板，待细胞融合后，加入含１或１０￣ｍｏｌ／Ｌ ＬＹ２９４００２的成骨诱导液（１０ ｎｍｏｌ／Ｌ地塞米松、 １０ ｍｍｏｌ／ＬＩ５．甘油磷酸钠和５０ ｍｇ／Ｌ磷酸抗坏血 酸）继续培养３或７ ｄ。以加入ＤＭＳＯ为对照组， 分别进行碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ） 染色、定量分析，茜素红（ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ）矿化染 色、定量分析，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ｐ－Ａｋｔ蛋白表达以 及Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ检测ＢＭＰ２、Ｒｕｎｘ２、ＯＰＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ 等基因表达。 ＡＬＰ染色观察及定量测定 ＡＬＰ染色：成骨诱导３或７ ｄ，吸弃６孔板内 培养液，ＰＢＳ冲洗３次，加入固定液３滴，固定 ３０ Ｓ；底物溶于二甲基甲酰胺，倒人缓冲液，再加 入固紫Ｂ混匀，配置成工作混合液；每孔加入等 量工作液１ ｍＬ，３７ ｃＣ孵育１ ｈ，倒置相差显微镜下 观察。ＡＬＰ定量：采用对．硝基苯磷酸盐（ｐ—ＮＰＰ） 法，ＰＢＳ冲洗，胰酶消化，刮下细胞，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，反复冻融３次至细胞完全裂解；将 ５０ Ｌ细胞裂解液、５０ Ｌ ｐ—ＮＰＰ（浓度１ ｍｇ／ｍＬ） 以及１００ ＩｘＬ ２×ＤＥＡ缓冲液充分混匀，３７℃孵育 ４５ ｍｉｎ，加入５０ Ｌ ３Ｎ ＮａＯＨ终止反应，在４０５ ｎｍ 处测定ＯＤ值；等量样品以ＢＣＡ法测定总蛋白含 量，于５６２ ｎｍ处测定ＯＤ值，分别以总蛋白含量 为校对值，得出ＡＬＰ活性。 茜素红矿化染色及定量测定 茜素红染色：ＰＢＳ冲洗３次，７０％冰乙醇固定 １ ｈ，去离子水洗３次，茜素红室温染色１０ ｍｉｎ， 去离子水洗３次，ＰＢＳ孵育１５ ｍｉｎ，去除非特异结 合，显微镜下拍照观察。茜素红定量：氯化十六烷 基吡啶（ＣＰＣ）孵育１５ ｍｉｎ，释放已附着于矿化结 节的茜素红，酶标仪扫描各孔５６２ ｎｍ波长的 封闭，加入兔抗人ｐ－Ａｋｔ抗体（１：５ ０００）４ ｏＣ孵育 过夜，ＴＢＳＴ洗涤，加入ＨＲＰ标记羊抗兔ＩｇＧ抗体 （１：１０ ０００）孵育４５ ｍｉｎ，ＴＢＳＴ洗涤，暗室显影 定影。 Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ检测 Ｒｅａｈｉｍｅ ＰＣＲ检测成骨分化相关基因：按Ｔｒｉｚｏｌ 法提取ｈＭＳＣｓ总ＲＮＡ，取１ ｇ总ＲＮＡ，利用Ｒｅ－ ｖｅｒｔ Ａｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｅＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ试齐０盒以２０ Ｌ 体系进行逆转录，获得相应的ｅＤＮＡ。配制１Ｏ Ｌ 实时定量ＰＣＲ反应体系，每反应管内加入ｅＤＮＡ 样本０．１ Ｌ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ”５ Ｌ和ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅⅡ０．２ Ｌ，引物终浓度为０．２ ｐ￣ｍｏｌ，／Ｌ。 ＰＣＲ循环反应条件：９５℃预变性３０ Ｓ；９５ ｏＣ ５ Ｓ， ６０℃３４ Ｓ，４０个循环。溶解曲线分析：９ ５℃１５ Ｓ， ６０℃６０ Ｓ，９５ ｏＣ １５ Ｓ。每次实验以相应融解曲线 和２％琼脂糖凝胶电泳来判断扩增产物的特异性。 ｃｔ值为每个反应管内荧光信号到达设定域值时所 经历的循环数，用２ △ｃ 法分析成骨分化基因的相 对表达水平。引物设计如下： ＧＡＰＤＨ 上游引物５＇－ＧＧＡＴＩ３＇ＧＧＴＣＧＴＡＴＩ＇ＧＧＧ－－３， 下游引物５＇－ＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ ＧＧＡＴＩ＇一３ ； ＢＭＰ２ 上游引物５ 一ＣＡＴＧＣＣＡＴＦＧＴＦＣＡＧＡＣＧ－－３， 下游引物５ 一ＴＧＴＡＣＴＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＡ一３ ； Ｒｕｎｘ２ 上游引物５ 一ＡＡＡＴＣＧＣＣＡＧＣ￣ＴＦＣＡＴＡ一３， 下游引物５＇－ＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡ一３ ； Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ上游引物５，＿ＡＣＣＣＴＦＣＣＡＡＧＴＡＡＧＴＣＣ－－３， 下游引物５＇－ＴＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＡＴ一３ ； Ｏｓｔｅｒｉｘ 上游引物５，＿ＣＣＴＧＣＧＡＣＴＧＣＣＣＴＡＡＴ－－３， 下游引物５＇－ＧＣＧＡＡＧＣＣＴＹＧＣＣＡＴＡＣＡ－－３。 统计学方法 实验数据以 －４－Ｓ表示，采用ＳＰＳＳ １７．０统计软 件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分 析，两两比较采用ＬＳＤ法检验。Ｐ＜０．０５表示差异 有统计学意义。 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志２０１４年９月第７卷第３期 ＣＨＩＮ Ｊ ＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳ＆ＢＯＮＥ ＭＩＮＥＲ ＲＥＳ Ｖｏ１．７ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０．２０１４ ｓｉｔｏｌ ４，５ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＩＰ２）磷酸化为三磷酸磷 酸抗坏血酸等诱导成骨分化成份，其磷酸化Ａｋｔ蛋 脂酰肌醇（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎ０ｓｉｔｏｌ ３，４，５ ｔｒｉｓｐｈｏｓ— 白出现阳性表达，进一步说明ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号参与 ｐｈａｔｅ，ＰＩＰ３） 。Ａｋｔ是一种丝氨酸／苏氨酸激酶， ＭＳＣｓ成骨分化调控。这一结论也在基因水平检测 约含４８０个氨基酸残基，又称蛋白激酶Ｂ（ｐｒｏｔｅｉｎ 中得到证实，在成骨诱导分化早期７ ｄ内，１和 ｋｉｎａｓｅ，ＰＫＢ）。ＰＩＰ３作为第二信使，能够将Ａｋｔ募 １０ Ｉｘｍｏｌ／Ｌ明显促进ＢＭＰ２、 Ｒｕｎｘ２、ＯＰＮ、Ｏｓｔｅｒｉｘ 集到质膜上，此时ＡＫＴ会分别被激酶ＰＤＫ１和 等４种基因ｍＲＮＡ表达。 ｍＴＯＲＣ２磷酸化，再将信号传递至ＧＳＫ．３、ＦｏｘＯ 综上，ＰＩ３ Ｋ／Ａｋｔ信号通路参与ＭＳＣｓ增殖和成 和ｍＴＯＲＣ１等效应蛋白¨ 。现有研究发现，ＩＧＦ．１ 骨分化调控。成骨分化伴随该信号通路下游Ａｋｔ蛋 等生长因子可激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号，下游效应蛋白 ｍＴＯＲＣ１／Ｓ６Ｋ１能促进成骨细胞分化 ］，并抑制其 凋亡… ，在体外破骨细胞上清液也可通过该信号 调节成骨细胞增殖和分化 。但有少数研究发现 ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号抑制成骨细胞分化＿ｌ ，且上述研究 多集中于定向分化细胞如前体成骨细胞系ＭＣ３Ｔ３． Ｅｌ，关于该信号对多能干细胞的分化选择和调控 机制不甚了解。 本研究选取健康成人ＭＳＣｓ做为实验对象，探 索ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号对ＭＳＣｓ增殖和成骨分化的影响。 增殖和分化并非一个序贯的进程，不可能在同一时 间内既促进干细胞增殖又促进其定向分化。本研究 首先在未加入成骨诱导液条件下，加入ＰＩ３Ｋ特异 性阻断剂ＬＹ２９４００２，观察抑制ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号对 ＭＳＣｓ增殖的影响，发现ＬＹ２９４００２可呈一定的剂 量依赖性抑制ＭＳＣｓ增殖，从２４起到７２ ｈ这一时 间段内１和１０ ｔｘｍｏｌ／Ｌ ２组增殖减低，特别是高浓 度组ｌＯｌ￣ｍｏｌ／Ｌ作用更为显著，１０Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ组在７２ ｈ 的增殖也明显地低于低浓度组１￣ｍｏｌ／Ｌ组。与之 相反，通过ＡＬＰ和定量测定，发现１０ ｔｘｍｏｌ／Ｌ的 ＡＬＰ活性最强，在不同时间都显著高于对照组和 １￣ｍｏｌ／Ｌ组，说明ＬＹ２９４００２具有促进ＭＳＣｓ成骨 分化的作用。经成骨诱导３、７ ｄ以及茜素红染色 和定量分析后，发现１和１０ Ｉ．ｚｍｏｌ／Ｌ组矿化量都显 著高于对照组，阻断ＰＩ３ Ｋ／Ａｋｔ信号亦可促进ＭＳＣｓ 矿化。如上所述，Ａｋｔ是ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号下游的主 要效应激酶，Ａｋｔ的活化以质膜募集方式启动，其 活化尚需１３０８和￥４７３两个位点分别被ＰＤＫ１和 ｍＴＯＲＣ２磷酸化¨ 。本研究通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实 ＬＹ２９４００２抑制Ａｋｔ蛋白１３０８位点磷酸化，说明 ＬＹ２９４００２通过特异性抑制ＰＩ３Ｋ而阻断其下游信号 转导。对照组只含有地塞米松、Ｂ．甘油磷酸钠和磷 白表达。在ＭＳＣｓ培养时加入ＰＩ３Ｋ抑制剂，细胞 增殖数量明显减少，但促进其向成骨细胞分化和矿 化，证实了增殖和分化之间的非共存关系，促进分 化的同时也阻止了干细胞重新进入细胞周期。 ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号可能参与ＯＰ致病，并与其他信号通 路之间存在协同作用。进一步研究ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号 通路调控ＭＳＣｓ、成骨细胞等细胞行为的具体机制， 将为基因靶向治疗和干细胞治疗ＯＰ提供实验 依据。 参考文献 ［１］Ｃｈａｎｄａ Ｄ，Ｋｕｍａｒ Ｓ，Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎ Ｓ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎ— ｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｎｃｈｅｍ，２０１０， １１１：２４９－２５７． ［２］Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｎ Ｓ，Ｒｏｍａｎ ＡＡ，Ｓｉｎａｉ ＣＪ．Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒ— ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２００９，６６：２３６—２５３． ［３］Ｄａｌｌｅ Ｃａｒｂｏｎａｒｅ Ｌ，Ｖａｌｅｎｔｉ ＭＴ，Ｚａｎａｔｔａ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒｃｕ— ｌａｔｉｎｇ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｂｎｏｒｍａｌ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００９，６０：３３５６—３３６５． ［４］Ｚｈｏｕ Ｓ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ＪＳ，Ｅｐｐｅｒｌｙ ＭＷ，ｅｔ ａ１．Ａｇｅ—Ｒｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｔｉｒｎｓｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙ－－ ｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ『Ｊ］． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ，２００８，７：３３５—３４３． ［５］Ｓａｍｉ Ａ，Ｋａｒｓｙ Ｍ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａ— ｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ：ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ，２０１３，３４： １９９１—２００２． ［６］Ｇｕ ＹＸ，Ｄｕ Ｊ，Ｓｉ ＭＳ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａ— ｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＭＣ３Ｔ３・－Ｅ１ ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒ－－ 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志２０１４年９月第７卷第３期 ＣＨＩＮ Ｊ ＯＳＴＥＯＰＯＲＯＳＩＳ＆ＢＯＮＥ ＭＩＮＥＲ ＲＥＳ Ｖｏ１．７ Ｎｏ．３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０．２０１４ ・２５７・ ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ ＳＬＡ ａｎｄ ＳＬＡ ａｃｔｉｖｅ ｔｉｔａｎｉｕｍ ２０１３，１３：１８８－２０４． ｓｕｒｆａｃｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ，２０１３，１０１： ７４８．７５４． Ｌｉｕ Ｘ，Ｂｒｕｘｖｏｏｒｔ ＫＪ，Ｚｙｌｓｔｒａ ＣＲ，ｅｔ ａ１．Ｌｉ￣ｌｏｎｇ ａｃｃｕｍｕ— ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ Ｐｔｅｎ ｉｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００７，１０４：２２５９－２２６４． ［７］Ｍｏｏｎ ＪＢ，Ｋｉｍ ＪＨ，Ｋｉｍ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａｋｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｃｈｅｎ ＬＬ，Ｈｕａｎｇ Ｍ，Ｔａｎ ＪＹ，ｅｔ ａ１．ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ ｐａｔｈｗａｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ＧＳＫ３１３／ＮＦＡＴｅ１ ｓｉｇ— ［１２］ ｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，１８８：１６３—１６９． ［８］Ｅｓｐａｇｎｏｌｌｅ Ｎ，Ｇｕｉｌｌｏｔｏｎ Ｆ，Ｄｅｓｃｈａｓｅａｕｘ Ｆ，ｅｔ ａ１．ＣＤ１４６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｎ ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ，２０１３，１９：２２２６—２２３２． ｔｈｅｉｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ『Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ ［１３］Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｙａｎｇ ＪＨ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＩ３ Ｋ／Ａｋｔ ｐａｔｈｗａｙ Ｍｅｄ，２０１４，１８：１０４．１１４． ｂｙ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒａｔ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ［９］Ｐｏｌｉｖｋａ Ｊ Ｊｒ，Ｊａｎｋｕ Ｆ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ＰＩ３ Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ， ２０１４，１４２：１６４—１７５． ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｅｈｅｍ，２０１３，１１４：２５９５—２６０２． Ｈｅｒｓ Ｉ，Ｖｉｎｃｅｎｔ ＥＥ，Ｔａｖａｒ６ ＪＭ．Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ［１４］ ［１０］Ｇｒｕｎｔ ＴＷ，Ｍａｒｉａｎｉ ＧＬ．Ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒｇｅｔａｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＰＩ３Ｋ／ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ，２０１１，２３：１５１５—１５２７． ＡＫＴ／ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ， （收稿日期：２０１４—０５・２９） 第七届国际骨质疏松及骨矿盐疾病学术会议开幕在即 由中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会、国际骨矿盐学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ） 和国际华人骨研学会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ）共同主办的第七届国际骨质 疏松及骨矿盐疾病学术会议将于２０１４年１０月ｌ６—１９日在厦门召开。 本次会议包括英文和中文会议交流两个部分。会议将邀请在骨质疏松和骨矿盐疾病领域知名的国际 和国内专家进行专题报告和讨论、论文交流、病例讨论、内容丰富并结合临床热点话题的专家见面会等 内容。大会组委会热切欢迎广大业内人士参会交流。 大会组委会 本刊编辑部