实验题目: 湖塘水体叶绿素a测定
姓 名： 学 号： 班 级： 组 别：第一组 指导教师：
1.实验概述
1.1实验目的及要求
(1)初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法;
(2)通过实验，掌握叶绿素。的测定方法及富营养化水样的前处理方法; (3)熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。
1.2实验原理
浮游植物的主要光合色素是叶绿素((Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c。叶绿素a (chl-a >存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。
浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法 1 广西大学环境工程基础实验 萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。 本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量侧定方法。 2.实验内容 2.1实验方案设计 每组选择一个池塘，实地取水样，测定水样的叶绿素a含量。 2.2实验条件 2.2.1 实验仪器: 1) 幼分光光度计1台; 2)抽滤装置(砂芯过滤器、负压表、真空泵等)1台; 3)4000r/min离心机1台; 4) 15mL带刻度及螺旋盖的离心分离试管6个; 5)恒温水浴锅1台; 6)直径47 mm的醋酸纤维滤膜; 8)超声细胞破碎仪 9 ) icm玻璃比色皿2个 10)表面皿若干 11)10mL比色管7个; 2.2.2实验材料 1）90%乙醇 2）1mol/L盐酸 2.3实验过程（实验步骤、记录、数据、分析 ） 2.3.1实验步骤 2 广西大学环境工程基础实验 (1) 水样预处理：实验水样由实验室培养的铜绿微囊藻稀释而得，分别取三组浓度水样各50ml，每组两个平行样。将水样通过醋酸纤维滤膜抽滤，抽滤时负压不应大于0.5大气压（50kPa）。抽滤完毕后，用镊子小心的取下滤膜，将其对着(有浮游植物样品的一面向里）再用普通滤纸吸压，尽量去除滤膜上的水分;滤膜放置表面皿上冷冻12h以上。 （2）Chl-a的提取:将滤膜剪碎，放入具塞离心管，加入6 mL热乙醇(75℃恒温提取2 min 后用细胞破碎仪破碎，超声时间3S，间隔2S，破碎5 min后，用少量上清液清洗细胞破破碎仪探头（小于1ml）。将装有提取液的离心管放入离心机，转速4000r/min下离心10min，将上清液移入10 mL比色管中，再用2 mL热乙醇提取液清洗、离心二次取得上清液清洗、离心两次取得上清液。最后将提取液定容到10 ml。 （3）Chl-a含量的侧定:用含90%的乙醇溶液座位空白对分光光度计调零。分别记录在750 nm与665 nm处各自的吸光度(分别记为750a和665妒，750 nm处的测定是用来进行浊度校正的，吸光度应很低。665 nm处的吸光)如拉在0.1-0.8单位之间。在比色皿内加入1滴1mol/l 盐酸使酸化，混匀1 min。再记录750nm和665 nm处的吸光度(记为750b和665b) 2.3.2数据记录和处理 两种波长下叶绿素吸光度测定原始数据： Ⅰ Ⅲ Ⅳ 编号 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 665a 0.090 0.090 0.090 0.090 0.259 0.259 0.259 0.259 0.248 0.248 0.248 0.248 665b 0.081 0.081 0.081 0.081 0.195 0.194 0.195 0.195 0.190 0.190 0.190 0.190 750a 0.026 0.026 0.026 0.026 0.033 0.033 0.033 0.033 0.030 0.030 0.030 0.030 750b 0.031 0.031 0.031 0.031 0.040 0.041 0.041 0.041 0.036 0.036 0.036 0.036 通过吸光度的差值来计算对浊度的校正： 665a-750a=校正后的665a的吸光度 3 广西大学环境工程基础实验 665b-750b=校正后的665b的吸光度 数据处理： 一号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.090-0.026=0.064 校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.081-0.031=0.050 三号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.259-0.033=0.226 校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.195-0.041=0.154 四号样：校正后的665a的吸光度=665a-750a=0.248-0.030=0.218 校正后的665b的吸光度=665b-750b=0.190-0.036=0.154 用校正后的665a与665b的吸光度值进行如下计算： 叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(VE×l) mg/m³ 式中：Ve———乙醇的准确体积ml; VE———水样的体积L; l———比色皿的长度cm. 一号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(VE×l) mg/m³ =29.62×（0.064-0.050）×10÷(2×1) mg/m³ =2.073mg/m³ 三号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(VE×l) mg/m³ =29.62×（0.226-0.154）×10÷(0.05×1) mg/m³ =426.5mg/m³ 四号样：叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(VE×l) mg/m³ =29.62×（0.218-0.154）×10÷（0.05×1）mg/m³ =379.1 mg/m³ 2.4结论 从计算结果对比来看，采样点水样的叶绿素含量较低，取样点水面虽有部分绿色藻类，但是可能由于雨水或取水样时人为等因素的影响使其冲散，也可能是水体中适合生长的优势藻类本身含有较少的叶绿素a。还有，2、3组为平行实验，但结果却有出入，其原因可能是由操作过程引起的，如萃取过程、定容过程、超声破碎完冲洗过程、转移过程和测量吸光度的过程等均有可能带来误差。 2.5思考题。 4 广西大学环境工程基础实验 1、查阅资料，根据所得的叶绿素a的含量，判断所测水样的富营养化程度，并说明依据。 查阅相关资料得： 表一 富营养化评价标准 从上面有关资料可以看出，1号为贫中营养，3、4号为重富营养。 2.试对乙醇-超声法的优缺点加以分析。 优点：有较高的精密度，操作简便快捷，重复效率高，减少了叶绿素a在提取分析过程中的损失，萃取效率高，误差小，而且乙醇对人体的健康影响小，较安全。 缺点：1、水浴温度、萃取时间把握的不够准确，过高或过低的温度、萃取时间的长短都会影响释放的叶绿素的含量进而影响测定结果。2、乙醇具有易挥发的特点，在实验过程中其浓度会降低而影响实验结果。3、向比色皿中加酸后让其静置一分钟时没有完全混匀，影响其吸光度的测定进而影响实验结果。 3.本实验还有哪些地方需要改进，请给出你的建议。 （1）应该对池塘多取几个代表性的监测点进行测定，以便为后面对池塘富营养化研究提供更为全面的数据； （2）叶绿素 4.为什么要用665nm和750nm这两个波长来测量进行计算？ 因为665nm波长处的吸光度较大，在0.1-0.8单位之间，可以减小误差；而750nm处波长的吸光度比较低，是用来消除悬浮物的干扰，进行浊度校正的。 5．为什么要加入盐酸进行酸化？ 答：存天然水体中，浮游植物中不仅存在着具有光合活性的叶绿素a，而且存在 5 广西大学环境工程基础实验 着没有光合活性的脱镁叶绿素a，因此应用叶绿素a作为浮游植物生产量的主要指标时需将叶绿素a与脱镁叶绿素a区分开来。叶绿素a经酸化处理后，镁原子被氢原子取代，叶绿素a降解为脱镁叶绿素a。脱镁叶绿素a与等量的叶绿a相 比，存 6 6 5 nm波长下,具有较低的消光系数,故要用酸化的方法测定叶绿素前后光密度的变化。 6.计算叶绿素a的公式的来因。 答：因为在测定过程中，根据测定原理，凡参与计算的各光密度值都应减750nm处的光密度值，以消除悬浮物质的干扰。首先测定酸化前和酸化后的光密度 E665b和E665a(酸化前测定的光密度值用D665b、D750b表示，酸化后测定的光密度值用D665a、D750a表示)。E665b=D665b—D750b E665a =D665a—D750a 根据Lorenzen公式。计算单位样品中叶绿素a含量，采用热乙醇为萃取溶剂，A = 11.5，K=2.43,比色皿光程为1cm，带入最后可得公式叶绿素a=29.62×(665a-665b)×Ve÷(VE×l) mg/m³。 2.6 参考文献 【1】 陈宇炜、高锡云，浮游植物叶素a含量测定方法的比较测定【J】． 湖泊科学，2000，12(2)：185-188． 【2】杨彩根、宋学宏、孙丙耀，浮游植物叶绿素a含量简易测定方法的比较 【3】梁兴飞、郭宗楼，超声辅助热乙醇提取法测定浮游植物叶绿素 a的方法优化【J】,水生生物学报（2006）856-861 【4】杨洪芳，丁峰元，陈德辉，乙醇-超声法在浮游植物叶绿素a含量测定中的应用【J】，海洋渔业（2006）309-313 指导教师评语及成绩： 成绩： 指导教师签名 批阅日期 6 因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容