２０１３年第５期 总第３８卷 ＣＨｌＮＡ Ｃ０ＮＤＩＭＥＮＴ 中国调味品 试验研究 产朊假丝酵母培养条件的优化研究 张倩倩ｈ ，管于平 ，刁爱坡 ，孙媛霞 （１．天津科技大学生物工程学院，天津３００４５７；２．中国科学院天津工业生物技术研究所，天津３００３０８） 摘要：利用摇瓶发酵优化产朊假丝酵母的培养条件，并放大至５ Ｌ发酵罐进一步优化，旨在获得更高的 茵体量。摇瓶发酵试验结果表明：产朊假丝酵母的最适接种量为５ ，（ＮＨ．）：ＳＯ．和ＫＨ２ＰＯ．的最佳 浓度分别为５ ｇ／Ｌ和１０ ｇ／Ｌ，发酵温度为２８℃。此外，通过对５ Ｌ发酵罐的进一步优化发现：当初始葡 萄糖浓度为３０ ｇ／Ｌ，发酵时间为１０ ｈ时，以１００ ｍＬ／ｈ的速度连续流加浓度为９０ ｇｌＬ的葡萄糖母液 １０ ｈ，产朊假丝酵母的生物量及收率达到最大值，分别为２４．Ｏｌ ｇ／Ｌ和０．４９ ｇ／ｇ，明显高于分批发酵模 式的１６．３９ ｇ／Ｌ和Ｏ．４４ ｇ／ｇ。 关键词：产朊假丝酵母；优化；补料分批发酵；生物量；收率 中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—９９７３．２０１３．０５．０１１ 文章编号：１Ｏｏ０—９９７３（２０１３）０５—００４３一Ｏ６ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＺＨＡＮＧ Ｑｉａｎ－ｑｉａｎ ”，ＧＵＡＮ Ｙｕ＝ｐｉｎｇ。，ＤＩＡＯ Ａｉ－ｐｏ ，ＳＵＮ Ｙｕａｎ－ｘｉａ。。 （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｉａｎｊｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｉａｎｊ ｉｎ ３００３０８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ５一Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｉｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｍｏｒｅ ｂｉｏｍａｓｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｉｇｈ— ｅｓｔ ｂｉｏｍａｓｓ ｉｓ ｏｎｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ５ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｉｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｔ ２８℃ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ５ ｇ／Ｌ（ＮＨ‘）２Ｓ０‘ ａｎｄ １０ ｇ／Ｌ ＫＨ２ ＰＯ．．Ｏｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｎｄ，ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ５－Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｒｅｖｅａ１ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｆ ２４．０１ ｇ／Ｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ０．４９ ｇ／ｇ ａｒｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｏｎｌｙ ｏｎ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ｗｈｅｒｅ ３０ ｇ／Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｉｎｉｔｉａｌｉｚｅ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ １０ ｈ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ９０ ｇ／Ｌ ｇｌｕ－ ｃｏｓｅ ｉｓ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｏｔｈｅｒ １０ ｈ ａｔ ｔｈｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ １００ ｍＬ／ｈ．Ｔｈｅ ｄａｔａ ａｒｅ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｕ— ｓｉｎｇ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓ ｏｎｌｙ １ ６．３ ９ ｇ／Ｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ０．４４ ｇ／ｇ ｙｉｅｌｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｂｉｏｍａｓｓ）ｙｉｅｌｄ 酵母营养价值很高，含有丰富的蛋白质（约占细胞 产朊假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）作为一种ＧＲＡＳ（Ｇｅｎ－ 干重的４５ ～６Ｏ ），维生素Ｂ、矿物质、核酸以及丰 富的酶类和生物活性物质，如辅酶Ａ、辅酶Ｑ、尿酸酶、 ｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）安全生物，它和啤酒酵母、克 鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）被美国的ＦＤＡ 谷胱甘肽Ⅲ等，是一种制备酵母抽提物的优质原料。 认证为可作为食品添加剂的酵母，广泛用于食品和制 收稿日期ｔ２０１２—１２—１Ｏ ＊通讯作者 基金项目 国家高技术发展计划（２０１２ＡＡ０２１４０３），滨海新区科技项目（２０１１－ＢＫ１２００４５）ｌ天津市科技计划项目（１１ＺＣＫＦＮＣ０２０００） 作者简介ｔ张倩倩（１９８７一），女，硕士，主要研究单细胞及酵母抽提取物的制备技术． 一４３— ２０１３年第５期 总第３８卷 ＣＨＩＮＡ ＣｏＮＤＩＭＥＮＴ 中目调味昌 试验研究 药业，它可以利用尿素和硝酸作为氮源，不需要添加生 长因子即可生长，还能够以各种废弃物为原料生产食 养２４ ｈ，每隔２ ｈ取样１次，稀释后于ＯＩ）６。。处测菌液 的吸光值，以空白培养基作为对照，进行３组平行实 验。根据上述测定结果，将复壮后的种子分别以２ ， ５％，８ 的接种量接种于５Ｏ ｍＬ基础培养基中，培养 过程与测定方法与上述相同。 １．２．１．２（ＮＨ．）：ＳＯ．浓度的优化 将复壮后的种子以５％的接种量接种于５Ｏ ｍＬ基 用蛋白质，如竹废水 、米糠 引、糖蜜Ⅲ以及马铃薯淀 粉废水 等，具有广泛的应用前景。 目前，国内外关于产朊假丝酵母的报道主要集中 在摇瓶水平上优化培养条件，以达到提高菌体生物量 或代谢产物的目的［ ，本文首先在摇瓶水平上优化 了产朊假丝酵母的培养条件，放大至５ Ｌ发酵罐进一 步优化，并探讨了恒速流加不同浓度的葡萄糖母液对 产朊假丝酵母发酵的影响，旨在获得更高的生物量，为 进一步制备酵母抽提物提供原料。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１菌种 产朊假丝酵母（ＣＩＣＣ １７６９，Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ），购买 于中国工业微生物菌种保藏中心。 １．１．２培养基 ＹＰＤ培养基：２％葡萄糖，２％蛋白胨，１％酵母浸 膏。 基础培养基：２ 葡萄糖，０．５ （ＮＨ。）。ＳＯ。， ０．３ ＫＨ２ＰＯ．，０．１ ＭｇＳＯ．・７Ｈ：Ｏ，０．０２ ＣａＣＩ２，ｐＨ ５．６。（其中５００ ｍＬ的三角瓶装液量为 １００ ｍＬ，２５０ ｍＬ的三角瓶装液量为５０ ｍＬ，１００ ｍＬ 的三角瓶装液量为２０ ｍＬ）。 １．１．３仪器与设备 ＵＶ－１８００紫外分光光度计，ＦＥ２０实验室ｐＨ计， ＩＳ－ＲＤＤ３恒温振荡箱，ＢＩＯＴＥＣＨ－５ＢＧ全自动５Ｌ发 酵系统，ＳＩＧＭＡ３－１８Ｋ高速冷冻离心机，ＡＬ２０４电子 天平，ＤＨＧ系列电热恒温鼓风干燥箱。 １．２方法 １．２．１摇瓶发酵优化培养条件 １．２．１．１ 培养基的选择及接种量的优化 挑取产朊假丝酵母单菌落接种于２Ｏ ｍＬ ＹＰＤ培 养基中，２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ培养１２ ｈ，转接于５０ ｍＬ ＹＰＤ培养基中，２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ继续培养１２ ｈ，然后 将复壮后的种子以５ 的接种量接种于５０ ｍＬ ＹＰＤ 培养基中和基础培养基中于２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培 一４４一 础培养基中，其中（ＮＨ．）。ＳＯ．的浓度分别为０，２，５， ８，１０，１５ ｇ／Ｌ，其他组分维持不变，于２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ 振荡培养１２ ｈ，进行３组平行实验，测量产朊假丝酵母 生物量以确定最佳的（ＮＨ．）。Ｓ０．的浓度。 １．２．１．３ ＫＨ２ＰＯ．浓度的优化 将复壮后的种子以５ 的接种量接种于５Ｏ ｍＬ基 础培养基中，其中ＫＨ。ＰＯ，的浓度分别为０，２，５，８， １Ｏ，１５ ｇ／Ｌ，（ＮＨ。）。ＳＯ。的浓度为优化后的结果，其他 组分维持不变，于２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养１２ ｈ，进 行３组平行实验，测量产朊假丝酵母生物量以确定最 佳的ＫＨ。ＰＯ．的浓度。 １．２．１．４温度的优化 将复壮后的种子以５ 的接种量接种于５０ ｍＬ基 础培养基中，其中（ＮＨ．）。ＳＯ．与ＫＨ２ＰＯ．的浓度为 优化后的结果，其他组分维持不变，分别于２６，２８，３Ｏ， ３４，３７℃，２００ ｒ／ｒａｉｎ振荡培养１２ ｈ，进行３组平行实 验，测量产朊假丝酵母的生物量以确定最适发酵温度。 １．２．１－５葡萄糖浓度的优化 将复壮后的种子以５ 的接种量接种子１００ ｍＬ 基础培养基中，其中葡萄糖的浓度分别为１０，２Ｏ，５０， ８０，１００ ｇ／Ｌ，其他培养基组分为优化后的结果，于 ２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养２８ ｈ，每隔４ ｈ取样１次， 进行３组平行实验，测量产朊假丝酵母的生物量及残 糖浓度。 １．２．２发酵罐发酵 １．２．２．１分批发酵 将复壮后的种子以５ 的接种量接种子５ Ｌ发酵 罐（装液量为３ Ｌ），进行分批发酵，葡萄糖的浓度分别 为１Ｏ，２Ｏ，３Ｏ，５０，８０，１００ ｇ／Ｌ，其他培养基组分为优化 后的结果，２８℃培养２Ｏ ｈ，转速为４００￣８００ ｒ／ｍｉｎ，通 气速率和溶氧分别维持在８ Ｌ／ｒａｉｎ，４５ （与转速偶 ２０１３年第５期 总第３８卷 ＣＨＩＮＡ ｃｏＮＤＩＭＥＮＴ 中国调味品 试验研究 联），利用５Ｎ ＮａＯＨ控制ｐＨ维持在５．６。 １．２．２．２补料分批发酵初始葡萄糖浓度及补料时间 点的确定 将复壮后的种子以５ 的接种量接种于５ Ｌ发酵 罐（装液量为２ Ｌ），进行分批发酵，初始葡萄糖浓度的 分别为１Ｏ，２Ｏ，３０ ｇ／Ｌ，其他培养基组分为优化后的结 果，控制参数与分批发酵的参数完全一致，分别于６， ８，１Ｏ，１２ ｈ取样测定菌体生物量及残糖浓度，以确定 初始葡萄糖浓度及补料时间点。 １．２．２．３补料分批发酵 将复壮后的种子以５ 的接种量接种于５ Ｌ发酵 罐（装液量为２．０ Ｌ），初始葡萄糖浓度为３０ ｇ／Ｌ，当发 酵时间为１０ ｈ时，以１００ ｍＬ／ｈ连续流加不同浓度的 葡萄糖母液１０ ｈ，其中流加葡萄糖母液的浓度分别为 ９０，１２０，１５０，１８０，２４０ ｇ／Ｌ，使得相当于葡萄糖初始浓 度分别为５０，６０，７Ｏ，８０，１００ ｇ／Ｌ，补料分批发酵的控 制参数与分批发酵的参数完全一致。 １．２．３分析方法 根据Ｍｉｌｌｅ￣ 。 的方法，利用ＤＮＳ法（－－硝基水杨 酸）测定发酵液残糖的浓度，其中葡萄糖作为标准样 品。 产朊假丝酵母生物量的测定方法：取３ ｍＬ发酵 液于１２０００ ｒ／ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ后获得菌体，蒸馏水洗 涤菌体３次，１０５℃烘干至恒重。 菌体收率（Ｙ ｓ）为消耗１ ｇ葡萄糖获得的菌体量。 产率为每小时平均获得的菌体量。 ２ 结果与讨论 ２．１摇瓶发酵优化培养条件 ２．１．１培养基的选择及接种量的优化 圈１产朊假丝酵母培养基的选择及接种■的优化 由图１（ａ）可知，产朊假丝酵母在ＹＰＤ培养基和 基础培养基中生长情况的对比，可以看出：此株酵母菌 在０．－￣４ ｈ适应新环境，生长缓慢；４～１２ ｈ营养物质丰 富，环境适宜，菌体呈指数增长Ｉ１２～２４ ｈ因营养物质 耗尽或有害物质的大量积累，菌体维持在一个相对平 衡的状态，故选择１２ ｈ作为后续摇瓶发酵的培养时 问；此外，可以看出：基础培养基较ＹＰＤ培养基更利于 产朊假丝酵母的生长，且基础培养基较为廉价，故选用 基础培养基作为后续研究。 由图１（ｂ）可知，不同的接种量对产朊假丝酵母生 长情况的影响，当接种量由２ 提高至５％时，ＯＤ 。。明 显增加；而接种量由５ 提高至８％时，ＯＩ）６。。基本维持 不变，故确定产朊假丝酵母的最适接种量为５％。 ２．１．２（ＮＨ．）２ＳＯ，及ＫＨ２ＰＯ．浓度的优化 表１不同浓度的（ＮＨ．）。ＳＯ．和ＫＨ２ＰＯ．对 产朊假丝酵母生物■及收率的影响 对于产朊假丝酵母发酵而言，无机盐往往是影响 其生长情况的一个重要因素，尤其是氮源、磷源。由表 １可知，不同浓度的（ＮＨ。）。ＳＯ。和ＫＨ２ＰＯ４对产朊假 丝酵母生物量及收率的影响，当（ＮＨ．）。ＳＯ。为５ ｇ／Ｌ， ＫＨ。ＰＯ．为１０ ｇ／Ｌ时，此株酵母菌的生物量及收率达 到最大值。 ２．１．３温度的优化 一４５— ２０１３年第５期 总第３８卷 ＣＨＩＮＡ Ｃ０ＮＤＩＭＥＮＴ 中国调味品 试验研究 一般来说，酵母菌的生长温度在２５～３５℃之间。 这是由于产朊假丝酵母为兼性厌氧菌，包含两条糖代谢 由图２可知，产朊假丝酵母在２６￣，３７℃之间的生长情 途径，当氧气充足的情况下，酵母菌将糖分解为Ｃ０２和 Ｈ：Ｏ，产生的能量供酵母菌大量繁殖，而在氧气缺乏的 情况下，酵母菌利用糖发酵产生酒精和Ｈ。Ｏ，同时也会 产生少量的副产物，如甘油、有机酸（主要是琥珀酸）、杂 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 况，可以看出，当温度在２６￣２８℃之间时，酵母菌生长 情况最好，但温度高于２８℃时，随着温度的升高，酵母 菌生物量明显下降，故认为２８℃为此株酵母菌的最适 发酵温度。 ｌ２ １０ 毫。 ｉ ６ 彝 矧４ ２ Ｏ ２６ ２８ ３０ ３２ ３４ ３６ ３８ 温度（℃） 圈２温度对产朊假丝酵母生物■的影响 ２．１．４葡萄糖浓度的优化 爱 鼷 ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ ２８ 培养时间（ｈ） 圈３摇瓶发酵中初始葡萄糖浓度对 产朊假丝酵母生物■及残糖浓度的影响 对产朊假丝酵母发酵而言可知，葡萄糖浓度是影响 其生长的关键因素。由图３，利用不同浓度的葡萄糖进 行发酵时，产朊假丝酵母生物量及残糖浓度随发酵时间 的变化情况。可以看出：随着初始葡萄糖浓度的增加， 菌体的生物量先增加后下降，而菌体收率却显著下降， 一４６一 醇油（高级醇）、醛类及脂类等。摇瓶发酵不能提供产朊 假丝酵母充足的氧气，故酵母菌会利用部分葡萄糖进行 无氧代谢，产生的酒精和其他副产物，使培 环境恶化， 抑制酵母菌的繁殖，同时高浓度的葡萄糖生成会导致 Ｃｒａｂｔｒｅｅ阻遏效应，抑制呼吸酶的活性以及造成酒精含 量的增加，从而影响酵母菌的繁殖［１¨。 此外，随着初始葡萄糖浓度的变化，酵母菌进入稳 定期的时间也不同，由于葡萄糖浓度为１００ ｇ／Ｌ，培养 时间超过２Ｏ ｈ时，虽然残糖浓度继续降低，但生物量 变化不显著，故选择２０ ｈ作为后续研究的培养时间； 葡萄糖浓度由１０ ｇ／Ｌ增加至５Ｏ ｇ／Ｌ时，产朊假丝酵 母生物量显著增加，而当葡萄糖浓度由５Ｏ ｇ／Ｌ增加至 １００ ｇ／Ｌ时，生物量变化不显著。综合考虑生物量、收 率及经济可行性，选择葡萄糖浓度为５０ ｇ／Ｌ，此时生 物量及收率分别为１０．９７ ｇ／Ｌ，０．２２ ｇ／ｇ。 ２．２发酵罐发酵 ２．２．１分批发酵 葡萄糖是影响酵母发酵的关键因素，故有必要根 据摇瓶发酵的实验结果，扩大至５ Ｌ发酵罐进一步研 究不同初始葡萄糖浓度对产朊假丝酵母发酵的影响情 况，表２为产朊假丝酵母在摇瓶发酵和发酵罐发酵中 的对比情况，可以看出：摇瓶发酵与发酵罐发酵随着初 始葡萄糖浓度的增加，菌体的生物量均是先增加后下 降，菌体收率呈下降趋势，这些与Ｐａｒｅｄｅｓ－ＬｏＰｅｚ［１２］的 报道相一致，同时，发酵罐分批发酵的菌体生物量高于 摇瓶发酵，是由于发酵罐培养能够提供菌体适宜的 ｐＨ值、高溶氧所导致的。此外，由表２可知，当葡萄 糖浓度高于５Ｏ ｇ／Ｌ时，发酵罐发酵的残糖浓度明显高 于摇瓶发酵，是由于发酵罐发酵溶氧充足，在一定程度 上抑制了产朊假丝酵母的酒精代谢途径，虽然延长培 养时间，生物量会在一定程度上有所增加，但是收率及 产率明显降低，不符合经济原则。因此认为葡萄糖浓 度为５０ ｇ／Ｌ时，分批发酵的生物量及产率达到最大 值，分别为１６．３９ ｇ／Ｌ，０．４４ ｇ／ｇ。 ２０１３年第５期 中国调味品 ＣＨＩＮＡ ｃｏＮＤＩＭＥＮＴ 一，Ｉ，，）越爱赛舔 试验研究 ∞ ∞：２ ｍ Ｏ 总第３８卷 裹２分批发酵中初始葡萄糖浓度对 产朊假丝酵母生物■及收搴的影响 ｌ０ ７．３５ｉ０．０９ ７．４０ｉ０．１４ ０．０９ｉ０．Ｏ０ ０．０４ｉ０．Ｏ０ ０．７４土Ｏ．Ｏ０ ０．７４ｉ０．０ｌ ２０ ８．５ｌｉＯ．３４ ｌ２．５０ｉ０．１９ ０．２０＋０．０４ ０．０５￣０．Ｏ０ ０．ｔ３士０．Ｏ０ ０．６３士Ｏ．０１ ３０ 一一 ｌ４．９５ｉ０．０７ 一一０．１４ｉ０．０１ 一一 ０．ＳＯ￣Ｏ．Ｏ０ ＳＯ ｌ０．９７ｉ０．２４ ｌ６．３９ｉ０．７７ ０．４４￣０．０６ １３．１６ｉｉ．２２ ０．２２￣０．０ｌ ０．４４￣０．０１ ８０ １１．８８ｉ０．ＩＩ １５．２８ｉ０．３０ Ｓ．１２ｉ０．３０ ４２．２２ｉ０．２２ ０．１６ｉ０．０２ ０．４０￣０．０ｌ １Ｏ０ ｌ】．２８ｉ０．１１ ｌ４．３８ｉ０．１３ ３０．３９￣１．８６ ５９．６１￣２．５２ ０．１６ｉ０．０３ ０．３６：１：０．０ｏ ２．２．２补料分批发酵的初始葡萄糖浓度及补料时间 点的确定 众所周知，补料分批发酵可以有效避免底物抑制， 减少有害代谢产物生成以及提高菌体对氧的利用率， 使菌体生长呈指数增长，以获得最高的生物量 ¨］。因 此，通过研究不同初始浓度的葡萄糖在不同发酵时间 的生物量以及残糖浓度，以确定最佳的初始葡萄糖浓 度以及补料时间点，具有极其重要的实用价值，由图４ 可知，当发酵时间为６ ｈ时，初始葡萄糖浓度对生物量 的积累影响不大；而发酵时间为６～１２ ｈ，当初始葡萄 糖的浓度为３０ ｇ／Ｌ时，生物量呈指数增长，且在１０ ｈ 时，生物量处于较高水平，而残糖浓度较低，选择此时 进行补料，有利于菌体快速增殖。故选取初始葡萄糖 的浓度为３０ ｇ／Ｌ，发酵ｌＯ ｈ时开始补料。 圈４ 补料分批发酵初始葡萄糖浓度 及补料时间点的确定 ２．２．３补料分批发酵 相对分批发酵而言，分批补料发酵能有效地保证 发酵过程中葡萄糖的供给，又可有效地消除葡萄糖对 产物合成所产生的阻遏或抑制效应，更有利于菌体生 长及代谢产物的合成，这些在Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ ＳＧ 一１利用甜高粱秸秆汁产单细胞蛋白的补料分批发酵 研究［１“，和Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ补料分批发酵的 菌体生长及能量代谢情况的研究［１５］均得到证明。 根据分批发酵的结果，采用恒速连续流加不同浓 度葡萄糖的补糖策略，以探讨补料分批发酵消除葡萄 糖阻遏的能力。由表３可知，以１００ ｍＬ／ｈ的速度连 续流加浓度为９０ ｅｌＬ的葡萄糖母液１０ ｈ时，产朊假 丝酵母的生物量及收率达到最大值，分别为 ２４．０１ ｇ／Ｌ，０．４９ ｇ／ｇ，明显高于分批发酵模式的１６． ３９ ｇ／Ｌ，０．４４ ｇ／ｇ，表明补料分批发酵有利于提高葡萄 糖的利用率及菌体的生物量。但随着流加葡萄糖母液 浓度的增加，生物量及收率却降低，残糖浓度升高，这 表明补料速度过快，菌体来不及消耗而导致葡萄糖的 累积，从而抑制菌体生长并导致呼吸抑制作用，产生部 分有害物质（乙醇、有机酸等），进一步抑制菌体生长。 如果通过降低补料速度减少底物抑制和产物的阻遏效 应，将延长发酵时间，使得发酵成本显著增加。综合考 虑，当初始葡萄糖浓度为３０ ｇ／Ｌ，发酵时间为１０ ｈ时， 以１００ ｍＬ／ｈ的速度连续流加浓度为９０ ｇ／Ｌ的葡萄 糖母液１０ ｈ的补糖策略最佳。 表３流加不同浓度葡萄糖对产朊 假丝酵母生物量及收率的影响 ３ 结论 产朊假丝酵母营养价值很高，含有丰富的蛋白质、维 生素Ｂ、矿物质、核酸以及丰富的酶类和生物活性物质，是 一种制备酵母抽提物的优质原料，具有很高的应用价值。 通过摇瓶发酵优化产朊假丝酵母的培养条件，研究发现： 基础培养基较ＹＰＤ培养基更利于产朊假丝酵母生长，最 适接种量为５ ／／，（ＮＩ０－Ｉ，）２ＳＯ，和ＫＨ２１＇Ｏ４的最佳浓度分 别为５ ｇ／Ｌ，１０ ｇ／Ｌ，发酵温度为２８℃，葡萄糖浓度为 ５Ｏ ｇ／Ｌ，此时生物量及收率分别为１Ｏ．９７ ｇ／Ｌ，０．２２ ｇ／ｇ。 此外，根据摇瓶发酵的结果，扩大至５ Ｌ发酵罐进一步优 化发现：当初始葡萄糖浓度为３Ｏ ｇ／Ｌ，发酵时间为１０ ｈ 时，以１００ ｍＬ／ｈ的速度连续流加浓度为９Ｏ ｇ／Ｌ的葡萄 一４７一 ２０１３年第５期 总第３８卷 中国调味品 ＣＨＩＮＡ ｃｏＮＤｌＭＥＮＴ 试验研究 糖母液１Ｏ ｈ，产朊假丝酵母的生物量及收率达到最大值， 分别为２４．Ｏ１ ｇ／Ｌ，０－４９ ｇ／ｇ，明显高于分批发酵模式的 １６．３９ ｇ／Ｌ，０．４４ ｇ／ｇ，表明补料分批发酵有利于提高葡萄糖 条件的研究［Ｊ］．饲料工业，２０１２，３３（６）：５７－６０． ［８］Ｈｅ Ｙ Ｑ，Ｔａｎ Ｗ Ｔ．Ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｔＯ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｗｉｔｈ 的利用率及菌体的生物量，为进一步工业化生产提供依据。 ｛－｜考文献： Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ ９９－１２５［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００６，４３（１－４）：９－１４． ［１］Ｌｉａｎｇ Ｇ Ｂ，Ｌｉａｏ Ｘ Ｙ，Ｄｕ Ｇ Ｃ。ｅｔ ａ１．Ａ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔＯ ｅｎ— ｈａｎｃｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｈ２ ０２一ｉｎｄｕｃｅｄ ＯＸ－ ［９３陈合，余建军，舒国伟。等．产朊假丝酵母１８０７高产培养基 的优化［Ｊ］．中国调味品，２０１０，３５（７）：５２－５４． ［１０］Ｍｉｌｌｅｒ Ｇ Ｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒ— ｕｉｒｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９５９， ３１（３）：４２６－４２８． ｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ［Ｊ３．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２００８，１００（１）：３５０－３５５． ［２］Ｌｉ Ｘ，Ｏｕｙａｎｇ Ｊ，Ｘｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎ— ｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｂｉｏｍａｓｓ ｕｓｉｎｇ ｂａｍｂｏｏ Ｅｌ１］Ｄｅ Ｄｅｋｅｎ Ｒ Ｈ．Ｔｈｅ Ｃｒａｂｔｒｅｅ ｅｆｆｅｃｔ：ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｙｅａｓｔ口］．Ｊ，Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．，１９６６，４４（２）：１４９－１５６． ［１２］Ｐａｒｅｄｅｓ－ＬｏＰｅｚ Ｏ，Ｃａｍａｒｇｏ－Ｒｕｂｉｏ Ｅ，Ｏｒｎｅｌａｓ－Ｖａｌｅ Ａ．Ｉｎ－ ｌｆｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ｙｉｅｌｄ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｖ－ ｉｔｙ，ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ｉｎ ｂａｔｃｈ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎ— ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅ— ＳＯＵｒＣｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，１００（１４）：３６１３—３６１７． ［３］Ｒａｊｏｋａ Ｍ ｌ，Ｋｉａｎｉ Ｍ Ａ，Ｋｈａｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎ— ｇｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００４，２０（３）：２９７－３０１． ＵＯＵＳ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｌｏｎ．Ｍｉｃｏｂｉｒｏ１．，１９７５，３１（４）： ４８７－４９１． ［４＂］Ｌｅｅ Ｂ Ｋ，Ｋｉｍ Ｊ Ｋ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ｂｉｏｍａｓｓ Ｏｎ ｍｏｌａｓｓｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｈｕｒａｌ Ｅｎ－ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，２５（２）：１１１－１２４． ［１３］Ｙａｍａｎｅ Ｔ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｓ．Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｍ］．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏ— ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８４，１４７—１９４． ［５］Ｇ６１ｉｎａｓ Ｐ，Ｂａｒｒｅｔｔ Ｊ，．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏ— ｃａｓｉｅｎｇ ｗａｓｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｙｅａｓｔ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，９８（５）：Ｉ１３８—１１４３． ［１４］庞会忠，叶亚健，王飞。等．利用甜高粱秸秆汁产单细胞蛋 ，．白的分批补料发酵研究［Ｊ］．中国饲料，２０１２（３）：１９－２１． ［１５］Ｐｈａｍ Ｈ Ｔ Ｂ，Ｌａｒｓｓｏｎ Ｇ，Ｅｎｆｏｒｓ Ｓ Ｏ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ［６］何东东。张坤生．产朊假丝酵母生长条件的优化［Ｊ］．食品科 技，２０１０，３５（２）：１４－１７． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ－ ｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉ０ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９８，６０（４）：４７４—４８２． ［７］李加友，蔡丽阳，于建兴，等．饲用产朊假丝酵母的发酵培养 一４８—