一氧化氮对果蔬采后保鲜机理的研究进展

摘要:近年来,一氧化氮(NO)作为一种气调保鲜剂,在果蔬采后保鲜方面逐渐引起人们的重视｡从各方面阐述了NO处理对延缓采后果蔬成熟衰老的机理和效果,包括NO抑制果蔬组织内乙烯､活性氧自由基的合成,促进抗氧化酶系活性,延缓组织呼吸作用,参与介导细胞凋亡,改善果蔬的品质特征｡综述了外源NO熏蒸对基因的差异性表达的影响｡

关键词:一氧化氮;果蔬保鲜;活性氧;细胞凋亡;保鲜基因

Study on Progress of Fresh Preservation Mechanism of Nitric Oxide on Vegetables and Fruits

Abstract: Nowadays, nitric oxide as an controlled atmosphere preservative that keep vegetables and fruits fresh, is paid great attention to preserve freshness gradually. The mechanism of delaying ripe and oldness of vegetables and fruits using nitric oxide treatment were explaimed including prohibiting vegetables and fruits tissue ethylene’s production, and synthesizing active oxygen free radicals, enhancing antioxidases activity, postponing tissue respiration, playing a part in cell death and improving vegetables and fruits’ quality. The effect of gene’s difference expression by nitric oxide fumigation was summarized.

Key words: nitric oxide; fresh preservation of fruits and vegetables; active oxygen; cell death; freshness gene

一氧化氮(NO)被认为是一种对环境和人体有害的气体,它被人吸入后产生类似一氧化碳的中毒症状,在空中会形成酸雨,亦是破坏臭氧层的因素之一｡20世纪80年代末,科学家发现NO广泛分布于动物体内各组织中,具有神奇的生理调节功能｡1992年被美国《Science》杂志评选为明星分子｡1996年,Leshem等[1]首次报道NO可在植物体内合成｡如今,NO已被认为是生物体内一种重要的调节生命活动不可缺少的信息分子｡近年研究表明,NO介导了植物防御相关基因的表达､细胞程序性死亡､脱落酸(ABA)诱导的气孔关闭,植物的呼吸作用[2-4]｡外源NO可通过抑制乙烯的合成,活性氧自由基的活性,来提高果蔬贮藏过程抵御逆境的能力｡徐福乐[5]已证明外源NO处理对果实采后对内源乙烯释放量和SOD､过氧化氢酶(CAT)､过氧化物酶(POD)､O2､丙二醛(MDA)等活性氧代谢指标有显著影响｡因此利用NO对植物的生理特征的调控作用,可以通过NO熏蒸来延缓植物组织的成熟和衰老, 延长蔬菜等组织的货架期[6]｡

1NO对采后果蔬成熟与衰老的调控

1.1NO与乙烯

乙烯是公认的未成熟果蔬的催熟剂,它是调控果蔬成熟与衰老的关键因子之一｡随着果实的成熟,以内源NO的含量逐渐降低,乙烯的水平逐渐升高｡而Leshem等[7]发现外源NO可以提高果蔬等组织的NO水平,抑制乙烯的产生,从而延缓果蔬等组织的成熟与衰老,延长其货架期｡任小林等[8]对苜蓿幼芽进行37℃热处理,发现随热处理时间的延长,苜蓿芽中的乙烯含量逐渐下降,而NO的含量逐渐升高｡在处理2 h后,芽中的乙烯含量几乎降至原来的1/3,而NO的含量却升高为原来的2倍｡

植物乙烯的生物合成过程包括以下步骤:蛋氨酸(Met)→S-腺苷蛋氨酸(SAM)→1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)→乙烯,其中ACC合酶(ACC Synthase,ACS)和ACC氧化(ACC oxidase,ACO)是乙烯生物合成过程中的两个关键调控酶｡NO抑制乙烯的生物合成可能与其降低ACC的含量以及抑制两个限速关键酶ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)和ACC合成酶(ACC synthase,ACS)的活性有关｡Leshem等[9]提出了NO在乙烯调控中的具体作用模型(图1)｡

在乙烯的生物合成中,ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)是两个关键酶｡ACC合成酶是乙烯合成的倒数第二个酶,生长素对其活性有促进作用｡ACC氧化酶至少有4种同工酶,同工酶I是最普遍的一种,抗坏血酸和Fe2+是其辅助因子｡NO和过氧亚硝酸盐通过调控ACC合成酶的活性调节物质(生长素)及ACC氧化酶的辅助因子(抗坏血酸和Fe2+)而抑制乙烯的生物合成,调控植物组织的成熟与衰老｡Ku等[10]认为,NO抑制乙烯的作用与1-甲基环丙烯(1-methylcyclop ropene,1-MCP)的机制相似,即NO与乙烯受体的金属离子结合,抑制乙烯-受体复合物的形成,阻断乙烯所诱导的信号转导,从而抑制乙烯的效应｡另外,越来越多的证据表明,活性氧也参与了从SAM到ACC的生物合成过程,并且可能在基因水平或蛋白质水平上调控ACC合成酶基因表达及其活力[11]｡活性氧的作用及其对乙烯生物合成的双重作用调节机理有待进一步探究｡

1.2NO与活性氧体系

NO调控活性氧体系对生物体有双重作用:低浓度NO能迅速清除超氧阴离子(O2-)和脂质自由基(R-),阻断包括脂质过氧化在内的ROS参与的各种伤害反应,诱导抗氧化酶基因的表达,起保护作用[12,13]｡高浓度NO与O2-相互作用生成大量的过氧亚硝阴离子(ONOO-),后者质子化形成强氧化性的过氧亚硝酸,破坏生物大分子的结构与功能,具有生物毒性[14]｡因此,要达到NO对果蔬的保鲜效果,须控制外源NO的处理浓度｡另外,NO可通过影响过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性调节内源H2O2含量[15]｡许多研究显示,NO和H2O2可能是胁迫信号转导的中心环节,介导多种信号途径｡

1.3NO与各种酶活性

抗氧化酶系的代表物有SOD､CAT､谷胱甘肽还原酶(GR)｡活性氧是引起果蔬组织衰败的重要原因之一,而这些酶与果蔬内部超氧自由基,过氧化氢等活性氧自由

基在果蔬内的平衡有密切联系｡如SOD的主要功能是催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,生成H2O2和O2,CAT及POD的主要功能是清除组织内的H2O2｡丹阳等[16]证明芥蓝采后SOD､CAT活性呈下降趋势,用外源NO处理的芥蓝SOD活性分别在采后第16天,CAT活性第10天(NO浓度为60 μL/L)和第16天(NO浓度为60 μL/L,100 μL/L)显著高于对照组,说明NO处理能够自贮藏中期开始抑制SOD和CAT活性的下降,从而保持了较高的超氧自由基清除能力,防止自由基对膜系统的损伤｡外源NO处理番茄､草莓的试验中,NO可使果实中的SOD､CAT､APX活性提高而使得衰老进程延缓｡

酚类物质代谢影响着水果褐化情况｡这类研究侧重于多酚氧化酶(PPO),过氧化物酶(POD)等的研究｡研究表明,果皮褐变是酚类物质酶促氧化的结果,POD在龙眼果皮酶促氧化中起重要作用[17]｡段学武等[18]发现随着果皮褐变指数的增加,POD活性迅速增加,NO处理显著抑制了POD活性,从而延缓了果皮褐变的增加｡利用NO供体物质硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP)处理龙眼后,其PPO､POD､苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性受到抑制,褐化程度降低,且体外试验表明NO对PPO､POD活性具有显著的抑制作用,这表明NO可直接作用于PPO､POD[19]｡5 μmol/L SNP显著增强了草莓果实CAT活性,抑制了PPO活性,并推迟了PPO活性高峰的出现[20]｡

2NO对果蔬的生理特征的影响

2.1NO与呼吸作用

任小林等[21]发现1.0 mol/L NO 极显著地抑制青椒的呼吸速率｡张少颖等[22]用NO处理采后番茄,对照果采后第八天出现呼吸高峰,处理果比对照推后2 d出现,延缓了呼吸作用｡Zottini等[23]以NO供体硝普钠(SNP)处理胡萝卜悬浮细胞后,发现24 h内硝普钠引起细胞总呼吸速率下降50%,并随后发现细胞总呼吸的下降主要是NO抑制果蔬线粒体细胞色素C氧化酶(COX)活性,而抗氰交替途径在硝普钠处理后不仅没有下降,反而升高,同时交替氧化酶的基因表达加强,这与Millar等[24]的报道是一致的｡

2.2NO与细胞凋亡

细胞凋亡是一种由病理性变化或剧烈损伤引起的由基因控制的､主动的细胞死亡过程｡在果蔬采摘､运输､贮藏过程中,果蔬组织受到病原菌的侵入及机械损伤是很难避免的｡在超敏反应(Hypersensitive respons,HR)中,必须破坏被病原体感染的宿主细胞,才能根除隐患,这是一种以牺牲少数细胞而保存｡细胞凋亡可以使某些细胞或组织执行新的功能以利于植物的进一步生长发育,也是植物本身的一种重要防御功能｡

目前,关于NO处理对细胞凋亡的影响以对动物细胞凋亡的报道居多｡Pedroso等[25-27]发现,NO发生剂硝普钠可引起大叶落地生根和短叶紫杉培养细胞凋亡,机械胁迫(离心)也有相同作用,同时诱发NO大量发生,而NO合酶抑制剂L2NMMA能够抑制机械胁迫引发的NO发生以及培养细胞凋亡,说明NO在植物

细胞凋亡调控中有重要作用｡用含无毒基因的细菌侵染大豆植物或悬浮培养细胞,能诱导NO迅速积累;用真菌激发子处理马铃薯块茎,同样观察到NO快速积累[26]｡植物细胞凋亡的发生机制是非常复杂的｡Delledonne等[28]在大豆细胞HR反应过程中发现,单独NO或活性氧的产生都不能引起细胞的过敏性死亡,只有当NO和活性氧的产生处于一定程度的平衡时,才会激活HR｡活性氧在NO介导的细胞凋亡中似乎扮演着重要作用,Delledonne等[29]发现用假单胞菌(Pseudomonas)处理过的大豆(Glycine max)细胞悬浮体系,NO使细胞产生活性氧(ROS)积累和发生过敏反应(HR),并诱导细胞程序性死亡｡

关于细胞凋亡的精确机制还不是很清楚｡NO可诱导细胞发生凋亡,但其分子机理有待阐明,根据目前的研究结果,李忌等[30]提出NO诱导细胞凋亡的作用途径如图2所示｡

2.3NO与果蔬色泽､品质

绿叶类蔬菜在保存过程中会随着叶绿素的降解､失重､黄化等系列变化而失去原有色泽｡NO和N2O能抑制果蔬叶绿素的降解｡花椰菜以NO熏蒸处理5 h后贮于20℃下,其绿色和硬度能明显保持[7]｡在叶菜贮藏中,失重的主要原因是蒸腾作用引起的失水,一般当失重率达到5%时,就会产生明显的失鲜现象[31]｡但经外源NO处理的芥蓝失重率与对照无显著差异,可见,外源NO处理对芥蓝采后失重无显著影响[16]｡果蔬类营养品质的变化表现在VC含量､总糖含量､氨基酸含量､叶绿素降解等方面｡任小林等[21]发现适当浓度的外源NO可以延迟青椒营养物质(VC)的降解,保持叶绿素含量｡瓜果类会因为果皮的褐变,果肉自溶现象而失去新鲜度｡而用0.5､1 mmol/L SNP处理龙眼后显著抑制了龙眼果实腐烂和果肉的自溶[18]｡NO处理对猕猴桃果实采后硬度､叶绿素､类胡萝卜素､可滴定酸下降速度明显延缓[32]｡

3NO处理对植物衰老成熟基因差异性表达的影响

NO通过不同的途径介导了对果蔬成熟与衰老的调控｡蔬菜的生命活动是在基因控制下进行的,无论是哪一种途径,当果蔬细胞信号转导机制捕获到了外源NO处理这一信号后会启动或关闭相关基因,或改变相关基因的表达强度,进而蔬菜的细胞代谢过程发生变化,使得果蔬呼吸作用减弱,营养消耗降低,保鲜期延长｡

有人提出番茄突变体基因rin基因是为了负责活化一系列不同成熟基因的一种调节蛋白编码的,rin突变体中,该调节蛋白发生了某些变化而丧失活化成熟基因的能力[33]｡这说明,在果实成熟过程中存在基因的活化与表达｡在番茄果实成熟时,新合成一种酶—多聚半乳糖醛酸酶(PG),它是由特异的mRNA控制的[34]｡热处理表明,果实软化的抑制与PG基因表达的抑制密切相关｡用外源NO处理延缓果蔬的成熟与衰老,可能是由于NO延迟了成熟基因的表达,阻碍了某些蛋白的产生｡我们把与增强果蔬保鲜效果的相关基因称为保鲜基因｡NO可能作为信号分子诱导抗氧化酶基因的表达,提高组织的抗氧化能力[12,13],从而增强保鲜效果｡关于NO是作用于保鲜基因,激发保鲜基因的表达的机制的研究目前还未见到相关报道｡

4结语

外源NO能有效延迟果蔬的成熟与衰老,但是它在空气中易被氧化成NO2,其半衰期仅为5~12 s｡因此外源NO熏蒸处理必须在无氧条件下进行｡高浓度的NO会对环境和生物体产生毒害,针对不同的果蔬类型,需加强研究其NO处理的最适浓度｡目前对外源NO的研究集中在果实类的保鲜方面,对于叶菜类的蔬菜如菠菜､白菜､莴苣等保鲜的研究不多｡随着在NO对果蔬保鲜方面的研究的深入,NO参与调控保鲜的机制会逐渐清晰｡关于保鲜机制问题,以下问题还有待解决:①两类腐败因子乙烯与活性氧自由基的关系;②NO对保鲜基因的调控机制;③保鲜基因表达水平的变化与果蔬保鲜效果之间的关系｡

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