化技术综述
摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。
关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化 1.前言 1.
1. 背景和意义
近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。
菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，
含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。例如，利用毕赤酵母分泌表达的硫代羟腈裂合酶已达到14.8g/L的高产率；而胞内表达的羟腈裂合酶达到22g/L的高产率。
然而在工业生产中，菌种呈现出自然变异能力，这种自然变异的结果往往导致菌种退化，表现出活力减弱、产孢子能力下降和发酵产物合成能力降低，甚至合成其他产物等。而造成菌种退化的本质原因是基因突变。在培养和保藏过程中，个别细胞或孢子发生基因突变而引起性状改变，在经历连续接种传代后，含突变基因的个体在数量上占优势时，即呈现出菌种退化现象。基因突变可以在自然条件下发生，更因菌种使用不当、保藏不善等因素而增加发生的机率，此外还与菌种的遗传稳定性有关。为防止巴斯德毕赤酵母菌种的退化，除控制传代次数、妥善保藏以及选择遗传稳定性高的菌种外，积极有效的菌种分离纯化工作就显得尤为重要。
1.
1. 研究进展
经过十几年的发展，毕赤酵母已经基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定，营养要求低、生产快、易于进行操作和培养等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模。此外巴斯德毕赤酵母还有以下优点：
1.
具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强、调控机理最严格的启动子之一。
2.
表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。
3.
菌株易于进行高密度发酵，外援蛋白表达量高。 4.
毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。
2. 菌株筛选及分离纯化实验方法 2.1 仪器和试剂 2.1.1 实验仪器
蒸汽灭菌器、无菌操作台、恒温震荡摇床、生物培养箱、电子天平、接种环、酒精灯、培养皿、试管、三角瓶。
2.1.2 实验试剂
酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂（均为分析纯），巴斯德毕赤酵母菌种（菌种购自国家菌种保藏中心）。
2.2 主要试剂配方 2.2.1 YPD液体培养基
1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。 配置方法：（以1L为例）
将10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖溶于1L水中，搅拌至溶解。 2.2.2 YPD固体培养基
1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂。 配置方法：（以1.5L为例）
将15g酵母膏，30g蛋白胨，30g葡萄糖溶于1.5L水中，最后倒入30g琼脂，搅拌至溶解。
2.3 实验过程
实验采用划线接种的接种方法，接种工具为接种环。 2.3.1菌株活化
将配置好的培养基分装至三角瓶中（250ml的三角瓶，装液量为25ml），分装6瓶。
在121℃、0.12MPa条件下，灭菌30min。灭菌结束后，待蒸汽灭菌器压力下降，温度冷却至室温时，取出所灭物品，置于无菌操作台中。
培养基温度冷却后，取出液氮罐中保存的原始菌种，在无菌操作台中，酒精灯火焰旁接种。将接种好的摇瓶置于摇床上，调整合适的温度和转速，培养48h。
2.3.2单菌落筛选 2.3.2.1平板接种
平板若干，试管若干，包好，与配置好的固体培养基一起灭菌（温度121℃、压力0.12MPa、时间30min）。
在无菌操作台中，将灭菌好的固体培养基（温度约45℃）摇匀，在酒精灯火焰旁迅速倒入平板（10ml/皿），冷却凝固后，烘干表明的水分，备用。
将培养好的摇瓶种子取出置于无菌操作台中，在酒精灯的火焰旁用接种环将种子接入培养皿，包好，倒置放入培养箱中，在30℃下培养48h。
2.3.2.2斜面接种
按照固体培养基的配方，配置500ml培养基，并用移液枪将培养基分装于试管中（以试管高度的1/4为宜）。将制备好的斜面包好，口朝上放入蒸汽灭菌器中，温度121℃、压力0.12MPa条件下，灭菌30min。
灭菌后，斜面温度50℃时，在无菌操作台内摆斜面且斜面高度不得超过试管高度的2/3。
取出培养好的平板，待斜面培养基冷却至室温，选取平板中菌落完整、菌群较大的单菌落接入斜面培养基，并包好放入生物培养箱，在30℃下，培养48h。
2.3.3菌株纯化
将培养好的斜面取出，检查其菌落特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要继续接入新斜面，再次进行纯化，重复以上步骤直到得到长势良好、纯培养的菌种。
3.总结
菌种的优选和分离纯化技术是微生物领域所必须掌握的基本技术。特别是微生物工程菌研究和生产进入商品化、专业化之后，菌种的培育工作显得尤为重要。本文根据毕赤酵母高密度发酵菌株生产的实践总结，为菌种的优选和分离纯化提供了技术参考，对微生物发酵高产、稳产具有重要的现实意义。
参考文献：
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