一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株[发明专利]

*CN103436498A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103436498 A(43)申请公布日 2013.12.11

(12)发明专利申请

(21)申请号 201310235414.8(22)申请日 2013.06.14(83)生物保藏信息

CCTCC NO：V201312 2013.05.28(71)申请人河南农业大学

地址450002 河南省郑州市文化路95号(72)发明人崔保安 陈红英 卢权威 郭官鹏

郭敬 李新生 魏战勇(74)专利代理机构郑州中原专利事务所有限公

司 41109

代理人范之敏(51)Int.Cl.

C12N 7/00(2006.01)C12R 1/93(2006.01)

权利要求书1页 说明书10页 附图7页权利要求书1页 说明书10页 附图7页

(54)发明名称

一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株(57)摘要

本发明公开了一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株，猪圆环病毒Ⅱ型(Circoviridae)，CCTCC NO：V201312。本发明对PCV2体外培养增殖条件进行优化并筛选出一株对PCV2敏感性较高的命名为

为PCV2进一步研究奠定L8的PK15细胞克隆株，

了基础。

CN 103436498 ACN 103436498 A

权 利 要 求 书

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1.一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株，其特征在于，猪圆环病毒Ⅱ型(Circoviridae)，CCTCC NO：V201312。

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说 明 书

一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株

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技术领域

[0001]

本发明涉及一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株。

背景技术

1974年，德国一个研究者从猪肾细胞系PK15(ATCC-CCL33)发现一个新的，没有致

病性的微小核糖核苷酸病毒样污染物。随后报道该污染物是一个二十面体，没有囊膜，有一个单股环状DNA基因组的病毒，是已知最小的能在哺乳动物细胞中进行自我复制的病毒，紧接着，命名为猪圆环病毒（PCV）。它主要感染单核/巨噬细胞系细胞，其中猪肺泡巨噬细胞是其主要的靶细胞。随后在德国、加拿大、大不列颠以及北爱尔兰进行猪的PCV抗体血清学调查，结果表明猪群中PCV普遍存在。用PCV试验感染9月龄大的猪，结果不发生临床疾病，因此认为病毒没有致病性。[0003] 90年代末期，从加拿大西部的患有消瘦性疾病的猪群身上第一次分离出类似PCV样的病毒。此后不久在美国北部和欧洲也分离出类似加拿大的病毒株。用单抗、多抗、基因序列分析都显示出这些毒株在免疫原性和遗传学与PCV的不同。因此提出，病猪分离的PCV为PCV2，之前PK15分离的PCV为PCV1。尽管PCV1无致病性，但广泛存在于猪体和猪源细胞系；PCV2具有致病性，可引起猪的多种疾病。PCV2和猪的一系列疾病综合症相关，科学术语称圆环病毒病（PCVD）。1996年首次报道消瘦综合症是加拿大西部的猪，1991年第一次在一个健康的SPF猪群中分离出PCV2。作者提出PMWS这个名词来描述其临床症状。感染猪的损伤部位检测出大量PCV2核苷酸和抗原，能分离出PCV2。在加利福尼亚6周龄的猪的间质性肺炎和淋巴结病能检测出PCV2基因组，也分离出一株PCV2病毒。1996-1997年，PCV2相关的消瘦疾病在法国和西班牙报道。从此以后，PCV2相关的PMWS在世界所有养猪国家争相报道。从1986年西班牙、英国和1989年日本的PMWS猪保存的组织病变样本中检测出大量PCV2抗原。此外，从一个回顾评价中发现，早在1969年就有PCV2在猪群中感染的证据。因此，不能说PMWS是一种新病，也不能说PCV2是一个新病毒。PCV2与另外一个在猪群迅速扩大的疾病相关，猪皮炎肾病综合症（PDNS），在一些国家PDNS已经达到动物流行病比例。尽管流行病学显示PMWS与PDNS可能是有联系的，但PDNS感染是否与PCV2有直接关系仍需要证明。PCV2是猪繁殖障碍的一个病因，能在新生猪心肌炎的心脏组织中检测出大量PCV2。PCV2抗原在增生性坏死性肺炎(PNP)猪的肺组织中大量检出，也能在母猪流产死亡综合症(SAMS)的母猪组织中检测出PCV2。PCV2也是猪呼吸道疾病综合症的一个诱因。[0004] 在PCVAD中，PMWS危害最大，它主要发生于5~16周龄的断奶仔猪，是一种以进行性消瘦和多系统病理损伤为主要特征的免疫抑制性疾病，并且易与其它病原并发或继发感染。据估计PCVD每年给欧盟带来6亿欧元的损失。直接损失来自于保育猪和育肥猪的死亡、淘汰猪。间接损失来自于为控制继发感染而投入的抗生素和为减少PMWS影响而投入的猪场管理费用。

[0002]

目前，对于PCV2引发的疾病还没有一个有效的预防措施，但首选方案还是对猪只

接种疫苗。疫苗研制上，遇到最大的困难就是PCV2病毒增殖滴度低的问题。病毒体外培养

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说 明 书

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增殖能力弱，很难满足疫苗生产要求。此外，没有一个固定的疫苗免疫效果评价标准，强毒感染动物模型反应结果不一。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株，分类命名：猪圆环病毒Ⅱ型，拉丁文学名：Circoviridae，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年5月28日, 保藏编号CCTCC NO：V201312。

[0007] 本发明的技术方案是：一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株，猪圆环病毒Ⅱ型(Circoviridae)，CCTCC NO：V201312。[0008] 本发明的有益效果是：本试验对PCV2体外培养增殖条件进行优化并筛选出一株对PCV2敏感性较高的命名为L8的 PK15细胞克隆株，为PCV2进一步研究奠定了基础。附图说明

[0009] 图1为组织病料中PCV2的PCR扩增结果，M. DNA Marker DL 2000; 1-2. 病料中的PCV2 PCR扩增产物; 3. 阴性对照；

图2为细胞毒PCV2全基因组的PCR产物，M. DNA Marker DL 2000; 1-2.细胞毒中PCV2的PCR扩增产物；3.阴性对照；

图3为PCV2毒株全基因组核苷酸序列比较，分别代表AY556476， AY556477， AY578327， DQ910866， DQ915587， DQ923524， EF210106， EF565364，EF592576， EU148504， EU386606， EU408780， EU547458， EU747085， EU921257， FJ804417， FJ870972， FJ905470， FN687856， GU049340， GU247992， HM038028， HM038032， HM776453， HQ378161，EU780074， JQ692110， AF055392， AF055394， EU148503，HZ09。▲ 表示实验室分离株；★ 表示2a,2b,2c参考序列；

图4为PCV2分离株基因组核苷酸序列的系统进化树，▲表示实验室分离株；图5为病毒传代PCR检测，M. DNA Marker DL 2000; 1-6.分别代表PCV2 1, 4, 8, 12, 16, 20代; 7.阴性对照；

图6为系列稀释法示意图；图7为L8细胞PCV1检测，M. DNA Marker DL 2000; 1. PCV1 PCR产物; 2.L8细胞; 3.阴性对照。

具体实施方式

[0010] 一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株，猪圆环病毒Ⅱ型(Circoviridae)，CCTCC NO：V201312。[0011] 一 猪圆环病毒Ⅱ型PCV2/HZ09株的分离鉴定及全基因组序列分析

1 材料和方法1.1 试验材料

肺脏和脾脏等2009年8月采自郑州某猪场疑似断奶后多系统衰竭综合征猪的淋巴结、

组织。aq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD18-T载体、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)和IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖)等购自宝生物工程(大连)有限公司；

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说 明 书

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胶回收试剂盒购于BioTeke公司；RPMI Medium 1640、新生牛血清购自索莱宝公司；兔抗猪IgG-FITC、D-Glucosamine购自Sigma公司；特异性抗PCV2抗血清购自VMRD公司。[0012] 1.2 引物设计

引物P1/P2参考文献（Kim et al., 2003）(表1)。引物P3/P4根据GenBank中PCV1、PCV2核苷酸序列，利用Olig06.0设计。引物 P1/P2和P3/P4分别用于PCV2的PCR检测和全基因组的扩增。引物由上海生物工程服务有限公司合成。[0013] 表 1 PCV2检测引物和全基因扩增引物

1.3 病料处理

将采集的淋巴结、肺脏和脾脏等组织混合，在无菌条件下将组织剪碎后，用无菌PBS液研磨制成1:5(W/V)的悬液，反复冻融3次，4000 r/min离心30 min，取上清过0.22 μm滤器除菌，加入青霉素1000 U/mL，链霉素1000 μg/mL，4℃作用6 h，-20 ℃保存备用。[0014] 1.4 病料PCV2的检测

取冻融过的病料8000 rpm离心10 min，取上清液200 μL，按常规的酚氯仿抽提法提取病毒DNA。具体步骤为：加入200 μL SDS裂解缓冲液，加入5 μL蛋白酶K(终浓度为200 µg/mL)，混匀后于55 ℃水浴1-2 h，随后加入同样体积平衡酚，混匀后12000 rpm离心5 min。取上清，分别用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇（24:1）、氯仿抽提后用1.5倍体积的异丙醇沉淀，-20 ℃沉淀1 h，12000 rpm离心5 min，70%乙醇洗涤3次，室温干燥，加入20 µL 无菌双蒸水溶解。PCR 25 µL体系：模板DNA 3 μL，上、下游引物P1/P2各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶12 μL，补无菌水至25 μL；混匀后进行PCR扩增。PCR 扩增程序为：95 ℃ 5 min之后，94 ℃ 40 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，30个循环后，72 ℃延伸12 min。反应结束后，取5 µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR的结果。[0015] 1.5 病毒的分离与培养

取1.3处理的PCR检测为 PCV2 阳性的组织病料样品，每 2 ml 加 100 μL 三氯甲烷室温处理10 min，将处于分裂期的 PK15 细胞，37 ℃培养1 h后弃上清，加入含有 300 mmol D-氨基葡萄糖的维持液继续培养 72 h 后收获病毒，通过用D-氨基葡萄糖处理 PK-l5 细胞促进PCV2繁殖。

[0016] 1.6 PCV2的间接免疫荧光鉴定

采用如下方法：接种分离所得病毒于96孔细胞板上培养的PK15细胞，37 ℃培养72 h后，用PBS洗涤3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次，晾干；用 0.2% Tritonx-100/PBS 处理接毒细胞，37 ℃ 10 min，PBS洗涤2次，晾干；每孔加正常兔血清封闭液37 ℃封闭1 h，倒掉；一抗处理，VMRD公司的多抗（1:1000）37 ℃孵育45 min，PBS洗

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5次；二抗处理，兔抗猪IgG-FITC(1:200) 37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；0.01%的Evans blue染色30 s，PBS洗3次；80%甘油封底，荧光镜检。[0017] 1.7 PCV2全基因组的PCR扩增

将上述细胞培养物冻融3次后，12000 rpm离心5 min，收集上清液，提取DNA，进行PCR扩增。PCR反应体系为模板DNA 3μL，上、下游引物P3/P4各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶12 μL，补水至25μL；混匀后进行PCR扩增。PCR 扩增程序为95℃5 min之后，94℃40 s，53℃50 s，72℃45 s，30个循环后，72℃延伸10 min。反应结束后，PCR产物电泳后于紫外分析仪下观察。

[0018] 1.8 PCV2全基因组序列的测定与分析

电泳、回收目的片段，按常规方法与pMD18-T载体连接、转化，提取质粒，经PCR、酶切鉴定后，鉴定为阳性的重组质粒送上海生物工程服务有限公司测序。采用DNAStar软件将克隆的序列与GenBank上获取的其它PCV2全基因组序列进行同源性比较，生成遗传进化树。[0019] 2 结果与分析

2.1 样品PCR检测结果

从郑州市某猪场疑似PCV2感染的猪病料中提取DNA，进行PCR扩增，扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测表明，病料样品中均扩增出1条约为500 bp的目的条带（图1），与预期结果相符合。

[0020] 2.2 PCV2的细胞培养结果

将PCV2 DNA 的PCR检测阳性的组织滤液接种于无PCV污染的PK15细胞，连续传代。在每代细胞毒中，用PCV2特异性引物都能扩增出PCV2的特异性目的条带，说明PCV2 已经在PK15细胞上增殖。将分离的PCV2命名为HZ09株。[0021] 2.3 荧光染色鉴定结果

HZ09株接种于 PK15 细胞，37 ℃ 培养 72 h 后，在接种的细胞培养物中均能观察到典型的特异性亮绿色荧光，而阴性对照、空白对照的细胞无特异性绿色荧光。[0022] 2.4 细胞毒中PCV2基因组扩增结果

以病毒细胞培养物提取的DNA为模板，用引物P3/P4扩增PCV2全基因组，均扩增出1条约1800 bp的目的条带，与预期的结果相符合（图2）。[0023] 2.5 序列的测定及分析

通过DNAStar对序列进行拼接和分析表明，分离出的PCV2全基因组序列均为1767 bp。序列同源性比较表明：HZ09株与实验室PCVl分离株之间的全基因同源性分别为74.6%，国内外30个PCV2株间的同源性为92.6％～99.9％。进一步分析结果表明HZ09株与国内FJ870972(黑龙江)亲缘关系最近，同源性高达99.7％；与国外的HQ378161(塞尔维亚)同源关系最近，同源性为96.3%。HZ09株与EU148504(丹麦)亲缘关系最远，同源性为94.4％（图3）。根据GenBank中国内外发布的30株PCV2基因序列绘出系统进化树（图4）。可以看出31株PCV2分成三个较大的分支，为PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c三个亚型（AF055392、AF055394和EU148503分别为PCV-2a、PCV-2b和PCV-2a的参考序列）。由图可见，HZ09株位于PCV-2a分支上，因此，HZ09株基因型为PCV-2a。HZ09株与FJ870972(湖北)关系最近，它们处在同一个小分支上，基因组长度均为1767 bp。总体而言，HZ09株同国内外分离

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株的亲缘关系很近，由此可表明世界范围内的PCV2的基因组变异度不大。[0025] 3 结论与讨论

PCV2分离时，用含有D-氨基葡萄糖的维持液，有利于病毒对细胞的适应，这可能与D-氨基葡萄糖诱导细胞进入S期，促进病毒的增殖有关。做间接免疫荧光时，最后用Evans blue染色30s，这样可以加深阴性和阳性细胞间的对比性，更容易观察。PCV2分布世界各地，世界各个国家所发布的PCV2毒株基因序列表明：PCV2的序列长度为1767 bp或1768 bp，也有1766 bp的报道。中国2001年首次分离的的3个PCV2（BF,BX和HR）都是1767bp；接下来分离的6株序列有5株1767 bp，1株1768 bp。本文分离的2株PCV2均为1767 bp，其中HZ09株ORF2为705 bp，推导编码233个氨基酸。[0026] 2008年，欧盟圆环病毒病委员会提出一个统一的PCV2基因型命名方法，把PCV2分为PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c。根据这个方法，当PCV2的ORF2序列之间的遗传距离大于0.035时就可以分为不同的基因型。通过进化树分析，中国大部分PCV2毒株被归为2a和2b，只有少许毒株为2d（仅在中国的新基因型），没有出现2c基因型。近十年，中国主要流行株为PCV-2b。本文分离的2株PCV2，一株为PCV-2a，另一株为PCV-2b，PCV2的流行正日趋复杂化。

[0027] 研究发现，PCV2往往和其他病原体共同感染猪体引起猪体发病。有临床调查表明：在中国，PRRSV、PPV、CSFV和支原体是其合并感染最常见的病原体，偶尔会有PRV。另有研究表明：PCV2与PRRSV共同感染的几率为52.3%，与PPV共同感染的几率为26.9%。2株PCV2毒株全基因的获得，为开展ORFs的功能研究、探索其毒力和免疫原性的研究奠定了基础。[0028] 二 猪圆环病毒Ⅱ型毒株河南分离株增殖条件的优化

1材料与方法

1.1病毒和细胞 PCV2/HZ09株保藏编号（CCTCC NO：V201312），PK15细胞冻存。[0029] 1.2主要试剂

1640培养基(索莱宝公司)、PCV2阳性血清（VMRD公司）;兔抗猪IG-g-FITC二抗（Sigma）公司；兔血清封闭液（博士德）；D-氨基葡萄糖（Sigma公司）;其它试剂均为分析纯试剂。

[0030] 1.3 IFA反应条件的选择

1.3.1 PCV2抗血清的工作浓度

将96孔板中长满单层的感染了PCV2的PK15细胞培养72 h后弃去上清，用PBS洗涤三次，37 ℃干燥30 min，再用4%的多聚甲醛37 ℃固定45 min，PBS洗涤3次；再用0.2%的Trition-100 37 ℃作用20 min，PBS洗涤3次；10%的兔血清37 ℃作用2 h，弃去不洗；用5%的兔血清将PCV2抗血清作1:500、 1:800、1:1000、1:1200、1:1600稀释，每个稀释度四个孔，50 μL/孔，37 ℃作用45 min，PBS洗涤5次；加入1:1000兔抗猪IG-g-FITC, 37 ℃作用1 h，PBS洗涤5次;80%甘油封底，荧光显微镜观察。[0031] 1.3.2兔抗猪IG-g-FITC的工作浓度

按1.3.1方法，加入1:800稀释的PCV2抗血清，37 ℃作用1 h，洗涤5次;将兔抗猪IG-g-FITC作1:300、1:600、1:800、1:000、1:1400稀释，37 ℃作用45 min，洗涤5次；80%甘油封底，荧光显微镜观察。

[0032] 1. 4 PCV2增殖条件的优化

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1.4.1 D-氨基葡萄糖的最佳浓度

将长势良好的感染了PCV2的PK15细胞用0.25%的胰酶消化，然后加入10%小牛血清的1640培养基，分装于无菌的96孔板中，每孔100 μL, 37 ℃, 5% CO2:温箱中静置培养，24 h以后，弃掉上清液。分别加入D-氨基葡萄糖的终浓度为0.25、0.5、1、2、3 mM 2%小牛血清1640培养基，每个稀释度4个孔(100 μL /孔)，同时设立阴性对照，放入CO2温箱中37 ℃继续培养，48 h后用IFA法检测每孔内的阳性细胞数，以阳性细胞数最多的孔所对应的D-氨基葡萄糖的浓度作为最佳浓度。[0033] 1.4.2 最佳收毒时间的确定

将长势良好的感染了PCV2的PK15细胞用0.25%的胰酶消化，然后加入10%小牛血清的1640培养基，分装于无菌的96孔板中，每孔100 μL、37 ℃、5% CO2温箱中静置培养，24 h以后，弃掉上清液。加入含2 mM D-氨基葡萄糖2%小牛血清的1640培养基，继续培养,培养24 h、48 h和 72 h，分别做IFA试验。确定最佳的收毒时间。[0034] 1.5 PCV2传代增殖

将一瓶25 ml状态良好的PK15细胞用0.25%的胰酶消化,加入5 ml含10%小牛血清的RMPI-1640培养液吹打，取2 ml加到新的25 ml的细胞培养瓶中，然后各加800 μL的细胞毒混匀，加培养基加到8 ml，37 ℃ 培养， 24 h后，弃去培养液，各加含2 mM D-氨基葡萄糖2%小牛血清的1640培养基维持液8 ml，继续培养48 h，48 h后，一瓶于-20 ℃冻融三次，保存于-20 ℃备用；另一瓶用0.025%的胰酶消化成单个细胞，一分为二传代，如此循环往复，直到第20代。[0035] 1.6 TCID50测定

用新消化的细胞液将20代的病毒液做10-1到10-7倍稀释后接种到96孔板上，每个稀释度8孔，同时设阴性对照。37 ℃, 5% CO2温箱中静置培养，24 h后，弃去培养液，加含2 mM D-氨基葡萄糖、2%胎牛血清的1640培养基维持液，每孔100 μL，继续培养48 h，弃去维持液，用PBS洗涤3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次，晾干；用0.2% Tritonx-100/PBS处理接毒细胞，37 ℃ 10 min，PBS洗涤2次，晾干；每孔加正常兔血清封闭液37 ℃封闭1 h，弃去不洗；一抗处理，VMRD公司的多抗（1:1000）37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；二抗处理，兔抗猪IgG-FITC(1:200) 37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；PBS洗3次；80%甘油封底，荧光镜检。[0036] 2 结果与分析

2.1 IFA反应条件的优化

2.1.1 PCV2抗血清最佳稀释度荧光显微镜下观察，1:800, 1:1000, 1:1200三个稀释度阳性细胞数量差不多，1:800稀释的孔，荧光强度亮。1:300, 1:600两个稀释度出现非特异性荧光颗粒较多，1:1600稀释的孔内阳性细胞数量及荧光强度明显减弱。因此，我们将1:800作为抗血清的最佳稀释度。

[0037] 2.1.2 二抗最佳稀释度

荧光显微镜下观察，1:300, 1:600, 1:800, 1:000四个稀释度阳性细胞数量和荧光强度均无明显差别，在1:1400稀释的时候，所对应得孔内的阳性细胞的数量减少，强度变弱。因此将1:1000作为二抗（IG-g-FITC）的最佳稀释度。

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2. 2 PCV2增殖条件的优化

2. 2.1 D-氨基葡萄糖的最佳刺激浓度

用3 mM和2 mM D-氨基葡萄糖刺激病毒增殖阳性细胞相差不大，比其他浓度的阳性细胞数要多，低浓度刺激效果不明显，因此将2 mM确定为最佳刺激浓度。[0039] 2.2.2 病毒培养最佳时间

培养72 h，细胞孔内的阳性细胞数量最多，到96 h，孔内的阳性细胞数量比之前有所减少。因此，接种病毒后培养72 h被作为最佳收毒时间。[0040] 2.3 PCV2增殖情况

传代过程中提取每代病毒DNA，用试验一中的检测引物P1/P2检测病毒增殖的情况，结果如图5，可发现随着传代的进行，扩增的目的条带逐渐变亮。[0041] 2.4 病毒效价的测定

经IFA试验测定第10、15、20代病毒的TCID50分别为103.2／0.1 ml 、104.5／0.1 ml、 104. 75／0.1 ml。

[0042] 3 结论与讨论

PCV2感染细胞没有细胞病变产生，给检测PCV2在细胞上的增殖传代情况带来很大困难。本研究采用IFA法检测病毒感染细胞中的抗原，该方法具有操作简便，抗原定位准确，特异性强等优点，适用于病毒的定性和定量。可以准确地反映病毒在细胞培养中的增殖情况。本研究对IFA法进行了优化，主要包括一抗和二抗的最佳稀释浓度以及最佳作用时间。结果显示，一抗1:800稀释，IG-g-FITC 1:1000稀释，作用1h，IFA效果最好。目前应用较多的是采用PK15细胞在体外培养PCV2，但是PCV2在PK15细胞上增殖滴度较低。关于PCV2体外细胞培养的适应性问题，国外学者做过一些相关研究。研究结果表明，PCV2在感染PK15细胞后不呈现细胞病变，病毒在细胞的增殖能力也较差，只感染大约20%的细胞。PCV2在PK15细胞上的增殖滴度，也就是我们说的TCID50/0.1ml一般在103-104之间，不超过104。出现这种情况的原因可能与该病毒在复制过程中过度依赖宿主细胞聚合酶有关，这种酶类主要在细胞繁殖S周期中合成，可以增加病毒的繁殖。用300 mM的D-氨基葡萄糖刺激细胞能够显著增加病毒的增殖能力。用D-氨基葡萄糖处理细胞后，有可能提高宿主细胞S期合成聚合酶的能力，使其量增加，其实际作用机理至今尚未研究清楚。D-氨基葡萄糖对细胞有很大的毒性，在实际操作中稍有不当，细胞会出现大状态不佳，传代时细胞死亡，导致细胞无法继续传代。本研究中用含D-氨基葡萄糖的维持液刺激感染PCV2的细胞。不用D-氨基葡萄糖处理，传代到20代时TCID50为104.375/0.1ml，用D-氨基葡萄糖处理时，第15代TCID50达104.5/0.1ml。从试验结果来看，用低浓度的D-氨基葡萄糖也可以有效地刺激病毒的增殖，并且不影响细胞的正常传代。

[0044] 本试验用低浓度D-氨基葡萄糖刺激感染PCV2的PK15获得一个较理想的病毒量，为以后进行PCV2在PK15细胞上的增值研究奠定了基础。[0045] 三 PCV2增殖敏感PK15细胞的克隆与筛选

1 材料与方法1.1 PK15细胞PK15细胞（冻存）。

[0043] [0046]

1.2 PK15细胞克隆

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PK15细胞复苏后培养于细胞瓶中长成细胞单层，用适量0.025%的胰酶消化，加入适量PRM-1640生长液（含10%犊牛血清和1%双抗）吹打，分散细胞成单个，加入PRM-1640生长液成5×104-1×105 cells/ml的细胞悬液。用系列稀释法进行细胞克隆（图6），操作如下：

（1）取一96孔板，除A1外，每孔100 μL PRM-1640生长液(含10%犊牛血清和1%双抗)；

（2）加200μL生长良好的PK15细胞细胞混合液于A1孔，然后用移液器吸100 μL到B1，混匀后，再由B1到C1，依次到H1，H1吸出的100弃去，操作避免泡沫产生；

（3）用8排枪第一列（A1-H1）每孔加100 μL生长液，混匀后，快速从第一列抽100 μL到第二列（A2-H2），再由第二列到第三列，依次稀释到最后一列，最后一列抽出的100 μL弃去，操作避免泡沫产生；

（4）用8排枪每孔加100 μL生长液，最终200 μL/孔。记号笔标记日期和细胞种类，放培养箱培养。

[0047] 培养5-7天，显微镜下观察，标记只有单个细胞团的孔，继续培养，待长满单层后用0.025%的胰酶消化下来转到24孔板然后再转到细胞瓶培养。[0048] 挑选单克隆株进行扩大培养，并用间接免疫荧光的方法检测其对PCV2的易感性。选择对PCV2增殖敏感的克隆细胞株，置于37 ℃温箱培养传代3次（一记为P1代），加入适量细胞冻存液冻存。

[0049] 1.3 PCV2增值易感PK15克隆细胞筛选

复苏不同的PK15克隆细胞，传3代后用0.025%的胰酶消化下来，加培养基，再加10%的病毒液充分混匀后封装到24孔板中，500 μL/孔，37 ℃，5% CO2温箱中静置培养，24 h以后，弃掉上清液。加入含2 mM D-氨基葡萄糖2%小牛血清继续培养48 h，用IFA检测病毒感染的细胞量，筛选出PCV2易感的克隆细胞。[0050] 1.4间接免疫荧光试验(IFA)

将上述的24孔板弃去维持液，用PBS洗涤3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次，晾干；用0.2% Tritonx-100/PBS处理接毒细胞，37 ℃10 min，PBS洗涤2次，晾干；每孔加正常兔血清封闭液37 ℃封闭1 h，倒掉；一抗处理，VMRD公司的多抗（1:1000）37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；二抗处理，兔抗猪IgG-FITC(1:200) 37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；PBS洗3次；80%甘油封底，荧光镜检。有荧光物质着染的细胞即为PCV2感染细胞。[0051] 1.5克隆细胞PCV1的检测

取克隆细胞液200 μL，反复冻融三次，按常规的酚氯仿抽提法提取DNA， PF: 5TTGCTGAGCCTAGCGACACC3; PR: 5TCCACT-GCTTCAAATCGGCC3，扩出PCV1 ORF1中的349 bp，PCR程序为：模板DNA 3 μL，上、下游引物PF/PR各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶12 μL，补水至25 μL；混匀后进行PCR扩增。PCR 扩增程序为：95 ℃5 min之后，94 ℃40 s，65 ℃50 s，72 ℃45 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5 µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR的结果。[0052] 1.6 PK15细胞的传代、冻存与复苏

将复苏后的PK15细胞培养于细胞瓶中，待生成至细胞单层，用适量0.025%胰酶消化，加入适量培养液（含10%犊牛血清和1%双抗）吹打，分散细胞成单个，加入培养液，分瓶后放置于37 ℃温箱培养1-2天，形成单层，再用适量胰酶消化，一直传代。传代过程中，取不同

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代次细胞加入适量细胞冻存液冻存。

[0053] 将P5, P10, P20代PK15细胞单层，用Hank' s液洗2次，加入适量0.025%胰酶消化，加入适量生长液，1000 rpm离心10 min，去上清，加入适量细胞冻存液（MEM）含30%犊牛血清、10% DMSO和1%双抗，悬浮细胞，同时，放置于-196 ℃条件下保存，每间隔1周取出1-2支复苏，观察细胞形态和生长活性。[0054] 1. 7病毒TCID50测定

用新消化的PK15细胞液将20代的病毒液做10-1到10-7倍稀释后接种到96孔板上，每个稀释度8孔，同时设有阴性对照。37 ℃, 5% CO2温箱中静置培养，24 h后，弃去培养液，加含2 mM D-氨基葡萄糖2%胎牛血清的1640培养基维持液，每孔100 μL，继续培养48 h，弃去维持液，用PBS洗涤3次，晾干；用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2次，晾干；用0.2% Tritonx-100/PBS处理接毒细胞，37 ℃10 min，PBS洗涤2次，晾干；每孔加正常兔血清封闭液37 ℃封闭1 h，倒掉；一抗处理，VMRD公司的多抗（1:1000）37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；二抗处理，兔抗猪IgG-FITC(1:200) 37 ℃孵育45 min，PBS洗5次；PBS洗3次；80%甘油封底，荧光镜检。根据Karber氏法计算病毒TCID50。[0055] 1.8 L8对PCV2增殖稳定性检测

L8克隆株的P5、P10、P15、P20分别接种等量的病毒，用IFA法检测阳性细胞数，观察不同代次间阳性细胞数的差异，来判定克隆株L8是否对PCV2增殖稳定。2 结果与分析

2.1细胞克隆与PCV2 IFA检测将PK15进行细胞克隆，获得6个克隆细胞株，分别为L1、L5、L6、L8、L12和L15。IFA结果显示，L8克隆细胞对PCV2最为易感， L8克隆细胞病毒感染后72 h，绿色荧光物质着染的PCV2阳性细胞数明显增多。[0057] 2.2 PCV1检测结果

用PCR方法对克隆株L8 PCV1的检测结果如图7），可见L8不含PCV1。[0058] 2.3 L8克隆PK15细胞培养PCV2毒株TCID50测定

将等量的PCV2病毒分别接种到L8和PK15母细胞，37 ℃培养48 h后，分别用IFA方法测定其TCID50。结果显示，细胞克隆株L8的病毒滴度达到106.25 TCID50/0.1ml。PK15母细胞增殖滴度达到104.75 TCID50/0.1ml。[0059] 2.4克隆细胞传代、冻存与复苏

将L8细胞传代至20代，均贴壁良好，细胞长成单层后形态一致。将P5、P10、P15细胞冻存于-196 ℃一个月，复苏后均生长良好。[0060] 2.5 L8对PCV2增殖的稳定性

P5、P10、P15、P20分别接毒72 h做IFA结果如下：阳性细胞数量无明显差异，可见筛选的克隆细胞对PCV2增殖比较稳定。[0061] 3 结论与讨论

通常情况下，PCV2增殖滴度太低，为了更好地进行PCV2体外感染实验研究，筛选对PCV2具有高感染性的细胞系是行之有效的方法之一。

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本试验采用系列稀释法对PK15细胞进行克隆。操作过程中为了更有效的获得细

胞单克隆株，接种到96孔板之前的消化非常关键，要保证细胞单个散在，这样出现单个细

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胞团的几率才会高。由于出现单个细胞团所需要的时间比较长，所以96孔板要用胶带密封，防止生长液挥发过快，必要时及时补充生长液。[0063] 目前，国外有学者已经筛选出PCV2高感染率的细胞株PK15-C1、PKKC，在研究中发现PK15细胞对PCV2的易感性呈多样化的，包含有高感染率和低感染率的细胞。由于细胞感染率的不均一导致PCV2在PK15上滴度较低。通过细胞克隆，从PK15母细胞中挑选出高感染率的PK15-C1，PCV2滴度能达到107 TCID50/0.1ml；PKKC，PCV2滴度达105.8 TCID50/0.1ml，且在培养6天后能出现细胞病变。本此试验采用系列稀释法（1）PK15母细胞消化成单个细胞，浓度在5×104-1×105 cells/ml；（2）在96孔板上进行两次连续稀释；（3）标记单细胞团，扩大培养；（4）IFA法鉴定克隆细胞对PCV2敏感性；（5）持续培养高感染率的细胞系。最后得到一株PCV2敏感度较高的细胞株PK15-L8，经检测没有PCV1污染，传代稳定，PCV2滴度达106.25个TCID50/0.1ml。

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图2

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图4

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