0、基因工程的技术基础和理论基础 1）理论基础：
40 年代确定遗传信息携带者，即基因的分子载体是 DNA 而不是蛋白质，明确了物质基础 50 年代确定 DNA 的双螺旋模型和半保留复制机理，明确自我复制和传递 60 年代提出中心法则和操纵子学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。
2）技术基础：
60 年代的琼脂糖凝胶和 Southern 转移杂交技术，用于 DNA 分离和检测 60 年代初 70 年代末，发现限制性内切酶和 DNA 连接酶，实现体外切割 70 年代中期，实现 DNA 分子的核苷酸序列分析技术
80 年代实现体外重组 DNA 并进入宿主细胞 1、基因工程研究的主要内容或步骤
① 从生物有机体基因组中，经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目的基因的 DNA 片段； ② 在体外，将带有目的基因的外源 DNA 片段连接到能够自我复制载体分子上，形成重组 DNA 分子； ③ 将重组 DNA 分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖； ④ 从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组 DNA 分子的受体细胞克隆；
⑤ 从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；
⑥ 将目的基因克隆到表达载体上， 导入寄主细胞， 使之在新的遗传背景下实现功产生出人类所需要物质。 能表达， 2、三位一体的基因概念
① 基因既是携带生物体遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。 ② 基因是染色体上的实体
③ 基因象链珠 （bead） 一样，孤立地呈线状地排列在染色体上 基因是功能、突变、交换“三位一体”的最小的、不可分割的、基本的遗传单位。
3、一位一体的基因概念
基因是一个具有特定功能的、 完整的、不可分割的最小的遗传单位。 基因内可以较低频率发生基因内的重组和交换。
4、顺反子假说
1 个顺反子决定 1 条多肽链。能产生 1 条多肽链的是 1 个顺反子， Cistron 是基因的同义词。在一个顺反子内，有 若干个突变单位：突变子 （muton） 。在一个顺反子内，有若干个交换单位：交换子（ recon ）。
5、全同等位基因
在同一基因座位 （locus） 中，同一突变位点（ site ）向不同方向发生突变所形成的等位基因 （homoallele） 。 6、非全同等位基因
在同一基因座位（ locus ）中，不同突变位点（ site）发生突变所形成的等位基因 （heteroallele） 。 7、重叠基因的概念及其生物学意义 概念：
大多数由一条 DNA 序列组成的基因， 仅有编码一种蛋白质的功能 （尽管基因在两端有非编码区， 并且在编码区内有 内含子 ）。但是，有些情况下，一条序列编码不止一种蛋白质。 生物学意义：
a）原核生物进化的经济原则 （较小的 C 值编码较多的基因信息 ）； b） 提高蛋白质的疏水性 ,以增强生物体自然选择的适应性。
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8、重复基因的概念及其生物学意义
概念： 在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。 生物学意义：
a）含有遗传调控信息 :一些基因呈高度重复排列，如核糖体ｒＲＮＡ基因。这些基因的重复排列方式可以快速、大 量地表达出蛋白产物，从而满足机体的需要；调控基因复制、转录、翻译。核酸碱基的错配更正，损伤修复，也受 重复序列的影响。重复序列还可以形成核酸的高级构象，进而进行各种表观遗传修饰。
b） 促使核酸包装成各种高级结构 : 重复序列能够特异性地结合一些蛋白质，从而使核酸序列形成二级、三级甚至更 高级结构。
c）通过染色体的异染色质化而关闭基因的表达
d）维持重要基因的正常结构，保证生命活动的正常进行：大量的重复序列保持重要的编码基因相对稳定，这才能维 持正常的生命活动；
e）为遗传变异和新基因的生成提供了空间，产生进化的动力：新变异或者新基因经常出现在容易发生突变与重组的 重复区域，既不会破坏原来的遗传信息，又可以提供突变进行的场所，产生新性状。 9、断裂基因的概念及其生物学意义 概念：
真核生物的结构基因是由若干 exon 和 intron 相间隔排列的序列组成的间隔基因（断裂基因） 。 a）Intron 并非“含而不露” ； b）Exon 并非“表里如一” ；
c）并非真核生物所有的结构基因均为 splittinggene 。
生物学意义： a） 有利于遗传的相对稳定 :即使错误剪接留下的 intron 部分 ,被 mRNA 监测系统降解 ,避免病变和死亡； b） 增加变异机率，有利于生物的进化：内含子增加了基因的长度，增加了基因内的重组交换几率，有利于形
成变 异和生物多样性； c） 扩大生物体的遗传信息储量：对 Exon 和 intron 不同方式的剪接（选择性剪接），形成不同的基因产物； d） 通过改变读码框架，利用 intron 编码基因。 10、跳跃基因的概念及其生物学意义 概念：
跳跃基因也叫做转座子，是一些能够从一个染色体位置转移到另外的位置的 DNA 序列。跳跃基因在生物体中广泛 存在。
生物学意义：
转座子对基因而言是一个不稳定因素， 他可导致宿主序列删除、 倒位或易位， 并且在基因组中成为可移动的同源区。 产生新的变异，有利于进化。
目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一， 其中的 一大类—反转录转座子具有分布广、 异源转座高和受组织培养诱导激活等优势， 因此它的发现和利用又为转座子标 签的应用提供了更广阔的前景。 此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具， 也将大大加速 植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子捕捉载体，效率比 T-DNA 标签高 11、假基因 在演化过程中，很多基因经过了复制，其中的一个版本积累了使其失去功能的突变。 ① 与正常基因结构相似但丧失正常功能的 DNA 序列；
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② 假基因都是在真核生物的基因组中发现的，在原核生物中未见报道 ;
③ 假基因由活化的原始基因突变而来，这是因为存在着在某个阶段伤及基因表达的一种或多种缺陷(如启动
子错 误、有缺陷的剪接信号、框架中有终止信号等)之故 ; ④ 大多数基因家族都有一些成员是假基因。
12、模糊基因
RNA 编辑造成了 mRNA 的密码子的大部分，使它们从无意义信使成为有意义的信使 ,它们原来的基因的 A 序列只
不过是一串简略的意义模糊的序列 (abreviateorcrypticgene) ，这一串简略的意义模糊的序列称为隐秘基因或模糊基 因 (cryptogene) 。模糊基因在病毒、原生动物、哺乳动物与植物中广泛存在。
13、表观遗传修饰的方式
① DNA 分子的特定碱基的结构修饰 ( 如胞嘧啶的甲基化 )；
② 染色质构型重塑 (chromatinremodeling)( 如组蛋白的构型变化 )：组成核小体的组蛋白可以被多种化学加合物所修 饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。
a) 组蛋白不同氨基酸残基的乙酰化一般与活化的染色质构型常染色质和有表达活性的基因相关联；
b) 组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置； ③ 基因组印记 :生物体中约有 1% 的基因并不按照孟德尔规律遗传，而是只表达来源于双亲中的某一单亲的基因 ,这
种现象称为基因组印迹，那个被掩盖了的基因叫做被印迹的基因。 DNA 甲基化是“ imprint ”的重要机制；
④ PTGS(RNAi) 。
14、从基因概念的发展说明 C 值矛盾形成的原因 一个物种的单倍体的染色体的数目称为该物种的基因组。单倍体基因组总 DNA 的含量的称为最大 C 值；编码基因 信息的总 DNA 含量称为最小 C 值。
C 值悖论 :
① 生物体进化程度高低与大 C 值不成明显正相关。 一些植物和两栖类动物， 它们的 DNA 含量高达 10－
10bp ， 而人类 DNA 含量仅为 10bp ； ② 亲缘关系相近的生物大 C 值相差较大； ③ 一种生物内大 C 值与小 C 值相差极大。
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原因： 真核生物基因组中存在大量的不编
DNA 序列，一般而言，越是简单的生物基因组不编码码基因产物的 DNA 序列越少，它们的结构
蛋白质的 DNA 含量所估计的基因数。 基因的数目越接近 15、限制修饰系统
限制修饰系统
( Restrictionmodificationsystem 或 R-M 系统)是一种存在于细菌(可能还有其他原核生物) ，可保 护个体免于外来 DNA (如噬菌体)侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
16、限制性内切酶的命名原则 宿主：属名第一字母、种名头两个字母；菌株或型号；序号：罗马字。例如 Hind Ⅲ限制性内切酶： Hin 指来源于 流感嗜血杆菌 (Haemophilusinfluenzae) ，d 表示来自菌株 Rd ，Ⅲ表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写； 现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写； Escherichiacoli 。
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17、限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成 ,识别序列的种类 ,是否需要辅助因子，分三类 (I,II,III) 也有分四类， IIs 类，即 II 亚类。
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18、限制性内切酶识别的序列的特点
1）识别序列长度：一般 4-8，最常见为 6；当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，在可识别序列完全随机的情况下，平 均 256 和 4096 个碱基出现一个识别位点。
2）识别序列的结构： ①多数为回文对称： 切割位点在 DNA两条链相对称的位置； ②少数限制酶的识别序列非对称； ③多识别序列 （简并序列 ）: 可识别多种序列； ④间断对称 : 有一些限制酶识别的序列呈间断对称， 对称序列之间含有 若干个任意碱基。
3）切割位置 : ①大多数内部；②一部分在两端；③还有一部分在两侧。
19、限制性内切酶产生的末端类型
1）匹配粘端 （粘性末端） :识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末 端（ cohesiveend ），这样形成的两个末端相同，也是互补的； 2）平端 （Bluntend）: 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链；
3）非对称突出端 :①来自非对称识别序列，切割的 DNA 末端是不同的；②简并序列；③间隔序列：间隔区域序列 是任意的；
4）同裂酶 （isoschizomer）: 识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。①同序同切，识别位点和 切割位置相同；②同序异切：识别位点相同，但切割位点不同；③“同功多位” ：识别简并序列的限制酶包含了另 一种限制酶的功能。
5）同尾酶 :许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同且对称，既可以产生相同的粘性末端。同尾酶切割 DNA 产生的末端可以进行互补连接。
20、位点偏爱产生的原因 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。
原因：
（1）Nar Ⅰ， NaeⅠ和 SacⅡ三种酶在切割 DNA 之前需要同时与两个识别位点作用的一类酶；
（2）BspMI 、 EcoRII 、HpaII 它们对要求作用的 DNA 序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的 变构位点 （allosteric） 。由顺式方式提供（ cis）：它们相互靠近或可形成环（ loop ），或由反式作用提供：其变构位点 由含识别序列的寡核苷酸提供； BspMI 难以切割 DNA ：在 pBR322 和 pUC18/19 中有一个 BspMI 位点， 100 倍的 过量切割时 /一半 DNA 未切割。
21、星星活性产生的原因 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制内切 酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。 限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关。最普遍的活性变化是①
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1 个碱基的变化；②识别位点外
层碱基的随意性以及单链缺口 引起星星活性的因素 : ① 高浓度甘油（ >5% ）； ② 酶过量（ >100U/ μg）； ③ 低离子强度（ <25mM ）； ④ 高 pH（>pH8.0） ；
⑤ 有机溶剂（如 DMSO ，乙醇，乙二醇等） ； ⑥用其它二价阳离子（ Mn++ ，Cu++ ，Co++,Zn++ ）代替 Mg++ 。
抑制星星活性的条件（措施）
① 减少酶的用量，避免过量酶切 ,减少甘油浓度； ②保证反应体系中无有机溶济或乙醇； ③提高离子强度到 100～ 150mM（ 如果不会抑制的话 ）； ④ 降低反应 pH 至 pH7.0 ； ⑤ 使用 Mg++ 作为二价阳离子。
22、酶切反应条件（缓冲液、双酶切策略、反应温度等） 1）缓冲液： ① 常规缓冲液：
pH ：通常 7.0-7.9（at25 ℃ ），用 Tris-HCl 或乙酸调节；
Mg++ ：作为酶的活性中心，由 10mMMgCl2 或 MgAc 调节，一般为 10mmol/L ；
DTT（ 二硫苏糖醇 ）1mM ：有抗氧化作用（强于巯基乙醇） ，保护酶分子上的还原性基团，稳定酶的活性；
BSA （ bovineserumalbumin ）（100 g/ml ）：少数需要（ BSA 是酶的稳定剂，防止酶分解和非特异性吸附； BSA 能 减轻有些酶的变性，能减轻有些环境因素如加热 ,表面张力及化学因素引起的变性； BSA 能防止酶吸附到管壁而损 失）。
离子强度：不同酶对离子强度的要求差异大，一般用 NaCl 来调节。
② 通用缓冲体系 : one-Phor-Allbufferplus,OPA+（ 通用缓冲液 ）: 可以适用所有的限制酶， 缓冲液包括 100mmol/LTris-HCl,500mmol/L 乙酸镁和 100mmol/L 乙酸钾；
不同酶使用的最佳浓度不同；常用浓度有 0.5X ， 1X， 1.5X ， 2X等。 ③ 双酶切策略 :
a）选用都合适的 Buffer 或通用缓冲液；
b）若找不到共用的缓冲液，可先用低浓度的，再加适量 NaCl 和第二种酶； c） 或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液。
2）反应温度 :大多数为 37℃，一部分为 50-65℃，少数 25-30℃；高温作用酶在 37℃时活性会下降，一般为最适条件 的 10-50% ；一般销售产品说明中都会表明最佳温度。 3）反应时间 :1hrormore ，许多酶延长其反应时间可减少酶的用量。
4）反应终止 :① EDTA （通过螯合镁离子） ，终 10mM ；②加热 :37 ℃酶 65℃或 80℃处理； 80℃处理 20min 仍失活的 酶，可以用苯酚去除蛋白。
23、酶切位点的引入方法
1）产生的 5'突出端补平后连接 :将产生的 5' 突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点。
2）同尾末端的连接 : 不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端在相互连接时，可以产生新的酶切位点，同时原先的酶切 位点消失。 3）平端连接。
24、甲基化酶概念和类型
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。在
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E.coli 中， 大多数都有三个位点特异性的 DNA 甲基化酶。在真核和原核生物中存在大量甲基化酶。 1) Dam 甲基化酶： GATC 腺嘌呤 N6 位置引入甲基；有些限制酶对 Dam 甲基化敏感，不能切割相应的序列，如 BclI,ClaI,MboI,XbaI 等；不敏感的有 BamHI,Sau3AI,BglII,PvuI 等。一般哺乳动物 DNA 不会在 A-N6 上甲基化； 当需要在敏感位点上完全切割 DNA 时，必须从 dam -E.coli 中提取 DNA 。 2) Dcm 甲基化酶：识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个 C 上 C5 位置上引入甲基。
3) EcoKI 甲基化酶：识别 AAC(N)6GTGC ；TTG(N)6CACG 序列中 AN6 位置；但识别位点少 (1/8kb) 研究较少。
4) SssI 甲基化酶：来自原核生物 Spiroplasma ，CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化，可在未甲基化或半甲基化链 上起作用。许多酶对此甲基化敏感。
25、甲基化对限制酶切的影响 1) 修饰酶切位点：
① HincII ：GTCGAC ，GTCAAC ，GTTGAC ，GTTAAC ；② BamHIGGATCC ；M.MspI ：CCGG ；如果 BamHI 前面为 CC 或后面为 GG ，那么 M.MspI 处理的 DNA 抵抗 BamHI 的切割。③构建 DNA 文库时用 AluI(AG ↓CT) 和 HaeIII(GG ↓CC)部分消化基因组 DNA ；用 M.EcoRI 甲基化酶处理， 然后加上合成的 EcoRI 接头，当再用 EcoRI 来切割时只有接头上的位点可被切割。 2) 产生新酶切位点；
3) 用于研究细胞 DNA 中位点特异性甲基化的水平及分布；
4) 对基因组作图的影响 : 在哺乳动物 DNA 中： CpG 序列出现的频率大约只有预计的 1/5；含 CpG 序列的识别序列 极其稀少；大多数 CpG 都发生甲基化；含 CpG 的所有识别序列的酶不能切割。
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26、常见 DNA 聚合酶类型及特点 真核细胞有 4 种 DNApoly α：位于细胞核内，催化细胞增生； β：小分子蛋白质( 4.4kDa )曾从小牛胸腺中提取，与细胞增生无关； γ： 100kDa ，利用 RNA 为模板的效率比利用 DNA 为模板的效率高； 其它：线粒体 DNA 聚合酶、催化线粒体 DNA 合成。 原核细胞三种 DNA 聚合酶，都与 DNA 链的延长有关 I ．单链多肽，可催化单链或双链 DNA 的延长
II 与低分子脱氧核苷酸链的延长有关 III 在细胞中存在的数目不多，是促进 DNA 链延长的主要酶 1) 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(EcoliDNApolymeraseI) ： ①活性：单链多肽 (109kDa) ，有三种活性。
a) 5'→ 3' DNA聚合酶活性。底物 : 模板 (ssDNA), 引物(带 3‘ OH基)或 5'突出 DsDNA；
b) 5 '→3'外切核酸酶活性。 底物 :dsDNAorDNA:RNA杂交体； 从 5'端降解 dsDNA，也降解 RNA:DNA中的 RNA(RNaseH 活性 ) ；
c) 3'→ 5'外切酶活性 (proofreading): 底物： 3'-OHdsDNAorssDNA; 从 3'-OH 端降解 DNA ，可被 5'→ 3'聚合 活性封闭。 ② 用途： a) 切口平移法标记 DNA：(所有 DNApoly 中只有此有此活性)产生切口，外切活性和合成活性共同作用使切口沿 5' --3 '方向平移；若有放射性 dNTP,则可标记成探针。
b) 用于 cDNA 克隆中的第二链， 即单纯的 DNA 聚合活性， 但由于有 5'---3'外切活性， 已不再使用， 而改用 Klenow 酶和反转录酶。
c) 末端标记(交换或置换反应) ： T4DNApoly 、T7DNApoly 更好。
2）Klenow 酶：Klenowfragment ：将大肠杆菌 DNApolyI 在蛋白酶 （枯草杆菌蛋白酶） 裂解 ,从全酶中除去 5'— 3' 外切活性片段，而聚合活性和 3'— 5'外切活性不受影响。 ①活性，共两种 , 同 DNApolyI 。 ②作用：
a） 补平 3'凹端，注意要用 dNTP，如果使用带标记的 dNTP，可对末端进行标记； b）抹平 3'凸端，注意必须加足量 dNTP； T4和T7具更强 3'--5 '外切活性，被取代
c）末端标记： A．置换反应同前 ,同样被 T4poly 代替； B．补平 3'-- 凹端的过程进行标记。
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d）cDNA克隆中合成第二链 e） 随机引物标记
f）DNA 测序（ Sanger 双脱氧链末端终止法）被 T7取代， Taq等 PCR酶。 g）PCR反应被 Taq 等取代
h） 在体外诱变中，用于从单链模板合成 dsDNA
3）T4 噬菌体 DNA 聚合酶 :
①活性与 Klenow 酶相似，但 3'— 5'外切活性强 200 倍； ②用途：
a） 补平或标记 3'凹端，必须有高浓度 dNTP（末端标记） b） 置换反应 : 必须有高浓度 dNTP（一种 ） 末端标记
c） 标记 DNA片段：即利用外切活性产生了 3'凹端，再补平（用标记的 dNTP）
4）T7 噬菌体 DNA 聚合酶 :来源于 T7phage 感染的 E.coli ，为两种紧密结合的蛋白质复合体 （基因 5 蛋白和宿主的硫 氧还蛋白 ）
①活性： T7DNApoly 为持续合成能力最强的一个，平均长度要大得多 ,在测序时具有优势； 活性/功能与 T4DNApoly 、 Klenow 类似，但 3'→ 5'外切活性是 Klenow 的 1000倍 ②用途 :
a）替代 T4 的功能 b）长模板的引物延伸
c）修饰的 T7DNApolymerase 用于测序反应（测序酶） SequenaseUSBBiochemical.99%3 '— 5'外切活性被除去 .
5）耐热 DNA 聚合酶
6）反转录酶 Reversetranscriptase: 依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶 ,具有 5'→ 3'合成 DNA 活性；无 3'→ 5'外切酶活 性。 ①种类
a）来自 AMV（禽成髓细胞瘤病毒） 。二链多肽 （62kDa/94kDa） ；具 5'→3'DNA聚合活性；具很强的 RNA酶 H活性（降 解与 DNA杂交的 RNA）；在反应开始时，引物和 mRNA模板杂交体可成为 RNaseH的底物 , 此时模板的降解和 cDNA的 合成相竞争；终止时， RNaseH可在正在增长的 DNA链近 3'端切割模板，趋向于抑制 cDNA的产量并限制其长度； b）Mo-MLV（M-MuLV）：Moloney 鼠白血病病毒。单肽 84kDaRNaseH活性弱，利于合成较长 cDNA；纯度高、工程产品， 42℃失活。 ②用途
a）cDNA克隆中第一链的合成
b） 测转录起始点（引物延伸法） c）5 '突出 DNA的补平
d） 测序反应 （ 当用 DNApolyI,Klenow 或测序酶不理想时 ） e） 其它 RT-PCRRNA二级结构 ③ 活性
a）5'→ 3'DNA 聚合活性（ Mg++ ） :RNAorDNA 模板及带 3'OH 的 RNA 或 DNA 引物 b）RNaseH 活性 ④ 注意事项
a）无 3'→ 5'外切校正作用，在高 dNTP 和 Mn2+ 时，每 500 个 bases 会有一个误掺入。 b） 为防止新合成的 DNA 提前终止，需高浓度 dNTP 。
c）单链拷贝，也可双链合成（自身序列为引物，但效率低） ,50 g/ml 放线菌毒 D ，抑制第二链合成。
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7）末端转移酶 : 来源于小牛胸腺 ,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的 DNApoly, 是不依 赖模板的 DNA 聚合酶 ;在二价阳离子存在下，末端转移酶催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3'羟基端。
①底物 DNA,可短至 3个核苷酸 ,对3'突出的末端底物效率最高； 低离子强度时 ,平端或 3'凹出端 DNA 亦可，但效率低； ②用途
a）在 3'端加同聚尾， cDNA 或载体，用于克隆，或标记 b） 末端标记 ddNTP（ 标记的 ）
27、 Weiss 单位和 NEB 单位
Weiss 单位：在 37℃下 20min 催化 1nmol32p 从焦磷酸根置换到 [ γ ,β -P]ATP 所需的酶量。
NEB 单位 （NewEnglandBiolabs）: 通过粘性末端的连接效率来表示。即，在 20 μl反应体系中于 16℃，使 Hind Ⅲ切过
的λDNA（300μg/ml，0.12μM5'末端）在 30分钟内连接 50%所需的酶量为 1个 NEB 单位。 1Weiss=67 粘端连接 单位 （NEB 单位 ）。 1NEB 单位 =0.015Weiss 单位。
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28、载体 由在细胞中能够自主复制的 DNA 分子构成的一种遗传成分， 通过实验手段可使其它的 DNA 片段连接在它的上面， 而进行复制。
29、作为基因克隆载体的条件
1）容量：分子较小，可携带比较大的 DNA 片段； 2）（复制：能独立于染色体而进行自主高效的复制；
3）酶切位点：有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiplecloningsites ， MCS ）； 4）标记：有适合的标记，易于选择；
5）安全性：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 6）表达：有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达；
30、质粒载体必须具备的基本条件并列举 2-3 种质粒载体特点 质粒载体必须具备的基本条件
1）具有复制起点：自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。 2）具有抗菌素抗性：理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
3）具有若干限制酶切单一位点多克隆位点（ multiplecloningsite ， MCS ）；
4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的质粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的转化给受体细胞， 同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低。
pSC101 质粒载体 :严谨型复制控制的低拷贝数大肠杆菌质粒载体，每个寄主细胞有 1～2 个拷贝；分子量 9.09kb ，
编码有一个四环素抗性基因（ tetr ）；有 Hind Ⅲ、 EcoR Ⅰ、 BamH Ⅰ、 SalⅠ、 Xho Ⅰ、 Pvu Ⅱ、 SmaⅠ 7种核酸内切 限制酶。其中在 Hind Ⅲ、 BamH Ⅰ、 SmaⅠ 3 个位点克隆外源 DNA ，都会导致 tetr 基因失活；是第一个真核生物 的克隆载体。
pBR322 质粒载体： 具有较小的分子量： 4363bp ，克隆载体的分子量大小不要超过 10kb ；具有两种抗菌素抗性基因 可供作转化子的选择记号；有 24 种核酸内切酶的单一酶切识别位点。其中 7 种内切酶的识别位点在四环素抗性基 因内部， 2 种识别位点在于这个基因的启动区内，所以 9 个限制酶切位点插入外源片断可以导致 tetr 基因的失活； 另外有 3 种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点。 31、 pUC 质粒载体的特点和优点
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应用多克隆位点技术，在 pBR322 的基础上，加入了一个在其 5'-端带有一段多克隆位点的 lacZ '基因。 1）典型 pUC 系列质粒载体特征： 来自 pBR322 质粒的复制起点；
氨苄青霉素抗性基因 （ ampr ），但它的 DNA 核苷酸序列发生了变化， 不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。 大肠杆菌β -半乳糖基因（ lacZ ）的启动子及编码α -肽链的 DNA 序列； 位于 lacZ '基因中的靠近 5'-端的一段多克隆位点（ MCS ）区段。 2） pUC 质粒载体的优点：
具有较小的分子量和更高的拷贝数：仅保留了 pBR322 的氨苄青霉素抗性基因和复制起点； 复制起点内部发生了自发突变造成了基因 rop 的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细 胞 500－700 个拷贝。
适用于组织化学检测重组体：具有来自大肠杆菌 lac 操纵子的 lacZ '基因，所编码的α -肽链可参与α互补作用， 用 Xgal 显色对重组子进行鉴定。
具有多克隆位点 MCS 区段：方便具有不同粘性末端的外源片段的插入。
32、穿梭质粒载体的概念 人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。
早期发现的大肠杆菌 -枯草杆菌穿梭质粒载体；大肠杆菌 -酿酒酵母穿梭质粒载体； 大肠杆菌 -牛乳头瘤病毒。
33、λ噬菌体载体的主要类型和特点
1）插入式载体 : 只具有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点的派生载体；通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段 插入的载体称为插入型载体。 由于λ噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制， 因此一般插入型载体设计为可插入 6kb 外源 DNA 片段，最大 11kb 。
①cI 基因插入失活：如λ gt10，基因 cI 内有一个 EcoR Ⅰ位点。其他 EcoR Ⅰ位点都去除掉了，基因 cI 内的 EcoR Ⅰ位点作为唯一位点，可用于外源 DNA 片段的插入。
外源基因插入后将导致 cI 基因的失活。 cI 基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生清晰噬菌斑。 ②LacZ 基因插入失活：如 gt11 载体
该载体最大特点是在最左侧可替代区置换了一段 lacZ 基因，可编码 -半乳糖苷酶，在 IPTG/X -gal 平板上形成兰 色噬菌斑。
lacZ 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoRI 位点，可用于外源 DNA 片段的插入。 筛选时，在 lac-宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，
可用免疫学方法筛选阳性重组子。
2）替换型载体（取代型载体） ：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λ DNA 区段可以被外源插入的 DNA 片 段所取代。
通过特定酶切位点允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体。如： EMBL3 和 EMBL4 EMBL3 和 EMBL4 载体为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb 、9kb 和 14kb。
克隆 DNA 片段大小为 9-23kb ，在填充片段两端带有对称的多克隆位点，这两个载体的差别是多克隆位点的排列位 置相反。
3）凯伦噬菌体载体：既有插入型，又有替换型，在基因工程实验中的用途十分广泛 承受外源 DNA 的能力：几个 kb 到 23kb 。
34、单链 DNA 噬菌体载体类型和特点
单链 DNA 噬菌体的复制， 以双链环形的 DNA 为媒介， 这种复制形式的 DNA（replicativeformDNA ）简称
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RFDNA ； 不论是 RFDNA 还是 ssDNA 都能感染大肠杆菌；
单链 DNA 噬菌体颗粒的大小，是受其 DNA 的大小制约的，不存在包装限制问题； 容易测定外源 DNA 片段的插入取向；
M13 ：一种含单链（ +）DNA （ ssDNA ）的丝状大肠杆菌噬菌体，基因组大小为 6.4kb ； 成熟噬菌体颗粒仅能感染 E.coli 的 F+ 细胞，其感染位点在性纤毛上；
噬菌体颗粒大小受其 DNA 大小制约，这一点正好与λ噬菌体相反。所以 M13 噬菌体并不存在包装限制的问题。 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质 复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ） ；
形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ） ； 结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ） ，所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中； 基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。
单链 DNA 的酶切和连接比较困难，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RFDNA 。 RFDNA 容易从感染细胞中纯化出来，可象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。
35、常用噬菌粒载体 pUC118 和 pUC119 的特点 常用噬菌粒载体 pUC118 和 pUC119
1）具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组 DNA ，可克隆 10kb 的外源 DNA 片段，易于进行分离与操作；
2）ampr 基因作为选择记号， 只有携带 pUC118 或 pUC119 噬菌粒载体的大肠杆菌转化子才能在含有氨苄青霉素的 培养基中生长；
3）拷贝数含量高，每个寄主可高达 500 个，只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体 DNA ；
4）存在着一个多克隆位点区，不同类型的外源 DNA 片段不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5）由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌 lacZ 基因的 5'-端编码区，可按照 IPTG 组织化学显色反应试验，筛选重组 子；
6）含有质粒复制起点，在无辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方式，复制形成大量的 双链 DNA 分子；
7）带有 M13 噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可合成单链 DNA 拷贝，并包装成噬菌体颗
粒分泌到培养基中；
8） pUC118 和 pUC119 ：多克隆位点区的核苷酸序列取向彼此相反，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链 DNA ，另一个则可转录出负链 DNA 。
36、柯斯质粒载体特点以及粘粒载体的工作原理
cosmid 载体：也称粘粒、柯斯载体。用于克隆大片段 DNA 的载体，由λ噬菌体的 co（s cohesive）末端及质粒（plasmid ） 重组而成的载体。
带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的 cos 末端等。 该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组 DNA 导入受体 细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒 DNA 的形式存在于细胞内。
柯斯质粒载体的特点： 具有λ噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能力；
具有与同源性序列质粒进行重组的能力。
粘粒载体的工作原理 类似λ噬菌体载体，在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于λ噬菌体载体的左右臂， cos 位点通过粘端退火后 与外源片段相间连接成多联体。
多联体与λ噬菌体包装蛋白混合，λ噬菌体 A 基因蛋白的末端酶切割两个 cos位点，并将两个同方向 cos
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位点之间 的片段包装到λ噬菌体颗粒中去。
噬菌体颗粒感染大肠杆菌时， 线状重组 DNA 就象 噬菌体 DNA 一样被注入细胞并通过 cos 位点环化， 这样形成 的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。 带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。
37、大肠杆菌表达载体组成和特点 表达载体组成：大肠杆菌表达载体都是质粒载体。 作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。 在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。 组成部分 1）启动子
强启动子、抑制型、诱导型与组成型
强启动子：目的基因在启动子指导下转录出大量 mRNA ，使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的 10% -30% 以上；
抑制型启动子： 启动子呈现出一种低的基础转录水平， 在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况 下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件； 诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如 IPTG ；
PL、PR、lac、trp、tac；T7 噬菌体启动子则属于组成型启动子
2）转录终止子 外源基因在强启动子控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物； 终止信号存在于聚合酶已转录过的序列之中，这种提供终止信号的结构就称为终止子。终止子分为两类：一类不依 赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用；另一类则依赖蛋白辅因子（ρ因子）才能实现终止作用。 两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点前有一段回文序列。
转录终止子能增强 mRNA 分子稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。
启动子封堵作用： 由一个上游启动子驱动的转录作用， 当其通读过下游启动子时， 便会使该启动子的功能受到抑制， 将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 3）转录起始序列
5' -末端结构特征，决定 mRNA 的转译起始效率。
在核糖体结合位点（ RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突 变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达；
4）转录增强子 : 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。
5）转译终止子
mRNA 转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌偏爱终止子 UAA ，尤其是在其后加上 U 形成 UAAU 四联核苷酸 的情况下，转译终止的效率将进一步的增强。
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38、 T7 噬菌体启动子的表达载体作用机制
T7 噬菌体启动子 PET 系列表达载体是目前使用最广泛的表达载体； 表达能力强；可控性好。其组成是在载体的基本结构的基础上加入 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点； 当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。
作用机制：
T7 启动子只能有 T7 噬菌体 RNA 聚合酶识别并启动转录， 大肠杆菌 RNA 聚合酶不能作用 T7 启动子； 宿主细胞必 须能表达 T7RNA 聚合酶；
大肠杆菌 BL21 （ DE3 ）：大肠杆菌染色体 BL21 区整合有噬菌体 DNA ，在 DE3 区有 T7RNA 聚合酶基因，该基因 受到 lacUV5 启动子控制；
当 PET 载体进入 BL21 （DE3 ），宿主细胞的 lacI 基因产生阻遏物，抑制 T7RNA 聚合酶基因的表达，载体上的目 标基因无法表达；
IPTG （异丙基硫代半乳糖苷，乳糖类似物）诱导后，和 lacI 产物结合，使其构象改变离开 lacO ，从而激活转录阻 遏物失去作用， T7RNA 聚合酶基因表达，产生 T7RNA 聚合酶，启动 T7 启动子控制的外源基因的表达。
39、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位以及特点
40、 PCR 扩增的技术原理以及 PCR 反应程序 原理:
PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法；优点：模板量少、无需纯化、快速特异、自动化。 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后， 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链； 成单链后， 温度降至 55℃左右， 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合； DNA 模板--引物结合物在 72℃、DNA 聚合酶（如 TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条 新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性 --退火 --延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链” ，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。
PCR 反应体系 :缓冲液、 dNTP 、引物、模板、 DNA 聚合酶。
PCR 反应程序 1）常规程序
将 PCR 反应所需的成分配置完后，在 PCR 仪上于 94-96 ℃预加热几十秒至几分钟，使模板 DNA 充分变性，然后
进入扩增循环。
在每一个循环中，先于 94℃保持 30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般 50-60℃之间），一般保持 30
秒钟，使引物与模板充分退火；在 72℃保持 1 分钟（扩增 1kb 片段），使引物在模板上延伸，合成 DNA ，完成一 个循环。
重复这样的循环 25～ 35次，使扩增的 DNA 片段大量累积。 最后，在 72℃保持 3-7min ，使产物延伸完整， 4℃保存。
2）复性（退火）和延伸温度
复性温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。
延伸温度绝大多数设定为 72℃；如果复性温度很高， 可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度， 变成二步法 PCR 。 4）循环次数
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3）反应时间
变性步骤一般使用 30 秒钟；
如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长，复性时间有 30 秒种一般是足够的； 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。
循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104～ 105 数量级时，循环数通常为 25～ 35 次； 平台效应( plateaueffect )： PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象； 原因：底物和引物的浓度已经降低， dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑 制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。
5) PCR 反应液的配制
PCR 反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。 常规方法与其它酶学反应一样， 在最后加入 DNA 聚合酶。 早期 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发；
对使用具 3‘ -5'外切活性的高温 DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物；遇到这个问题时，若将反应成分分开配 制， A 管含模板、引物和 dNTP 及调整体积的 H2O ，B 管含缓冲液、 DNA 聚合酶，然后再将两管溶液混合起来， 可较好地克服这个问题； 按照常规方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动( hotstart ) PCR 操作方式可较好解决这一 问题。将 dNTP 、缓冲液， Mg2+ 和 primer 先配制好， 然后加入一粒蜡珠 (如 AmpliWaxPCRQam100 )，加热熔化， 再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有当 PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔 化，所有反应成分才会混合在一起。 41、长片段的 PCR 扩增方法
常规 PCR 反应产物一般在 2kb 以下。在 PCR 反应中，随着扩增片段的延长，扩增效率随之降低。 在长片段的 PCR 扩增过程中存在如下问题： 高温会降低缓冲液缓冲能力，从而损害模板 DNA 和 PCR 产物； 高温下其它二价离子的存在会促进 DNA 的裂解； 长片段 DNA 分子的变性比短片段困难；
DNA 聚合酶与模板 DNA 的趋近和结合变得困难； 错配碱基的掺入导致 DNA 聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度。
提高扩增产物的长度采取措施： 改进缓冲体系，适当升高镁离子浓度( 10X 长片段 PCR 缓冲溶液组成为： 500mmol/LTris -Cl(pH=9.0),160mmol/L 硫酸铵， 25mmol/LMgCl2,1.5mmol/LBSA )；
采用混合 DNA 聚合酶，即主体使用扩增效率高、延伸能力强的 TaqDNA 聚合酶，少量使用具有 3‘ -5'外切活性 的高温 DNA 聚合酶(如 Pfu 或 PwoDNA 聚合酶)，及时切除不匹配碱基的掺入，这样可使扩增长片段 DNA 有效 实施；
当需要扩增的片段大于 20kb 时，需加入高浓度的甜茶碱 (终浓度为 1.5-2.0mol/L) 来提高 PCR 的效率， 但甜茶碱加 入后，要将扩增反应的温度降低 2-3 度；
Roche 公司的长片段 PCR 扩增试剂盒将 TaqDNA 聚合酶和 PwoDNA 聚合酶接合起来，可扩增长达 40kb 的 DNA 片段。
42、 PCR 扩增未知 DNA 片段方法
1) 反向 PCR ： 当获得一段 DNA 后，若要得到与其相邻的未知 DNA 片段，可通过反向 PCR 来实现； 反向 PCR 主要解决侧翼未知序列没有引物可用的问题； 首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板 DNA ，再将酶切后的 DNA 片段连接成环状分子， 其中至少有一 个环状分子含有完整的已知片段。 根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的 DNA 片段扩增出来。
反向 PCR 技术主要用于克隆已知 DNA 片段周边的未知 DNA 片段以及从总 RNA 中克隆未知 cDNA 序列，研究病 毒序列、转基因和转座子等的整合位点区域的序列。 2) 利用接头的 PCR
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将基因组 DNA 用限制性酶切酶进行酶切，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段的两侧，以提供 PCR 需要 的另一端引物； 根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可以将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。
3) TAIL -PCR( thermalasymmetricinterlacedPCR ):交错式热不对称 PCR ，是一种染色体步移技术
( GenomeWalking )； TAIL -PCR 通过 3 个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的 PCR 循环，利用不同的退火温度选择性地 扩增目标片段；
在利用特异引物和随机引物进行 PCR 中一般有 3 种产物生成：由特异性引物和简并引物扩增出的产物；由同一特 异性引物扩增出的产物；由同一简并引物扩增出的产物。
43、 Southern 杂交的基本流程和原理 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链 DNA 探针的杂交作用检测这些被转移的 DNA 片段，这种实验方法叫做 DNA 印迹杂交技术。 其基本原理是将待检测的 DNA 样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号。通过 Southern 杂交可以判断被检测的 DNA 样品中是否有与探针同源的片段以及 该片段的长度。
步骤： (1) 酶切 DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段 ,然后使 DNA 原位变性。 (2) 将 DNA 片段转移到固体支持物 (硝酸纤维素滤膜或尼龙膜 )上。 (3) 预杂交滤膜 ,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源 DNA 片段杂交 ,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的 DNA 所在的位置。
44、化学测序法和双脱氧法测序原理 1) 化学测序法：
G 系统： pH8.0 ：硫酸二甲酯→ G→m7G→C8~N9 断裂→脱 G；
A+G 系统： pH2.0 ：哌啶甲酸( pidine )→嘌呤环 N 质子化→脱嘌呤； C 系统： 1.5mol/LNaClC+ 肼( hydrazine )→脱 C ；
T+C 系统：肼 (hydrazine) →打开嘧啶环→重新 5C 环化→脱嘧啶。 ①先用限制性内切酶把 DNA 切成 100— 200bp 的测序材料； ②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除 5‘末端上的磷酸； ③ 在 5‘ -OH 端标记 32P，用多核苷酸磷酸激酶催化； ④ 标记片段变性为单链；
⑤ 化学试剂在特定碱基位置降解单链 DNA ，产生一组长度不等的 DNA 片段； ⑥经电泳和放射性自显影后，从 4 个反应系统统一阅读，待测 DNA 的全部核苷酸序列就可直接读出。
2) 双脱氧测序法：
DNA 聚合酶能够用单链 DNA 作为模板，合成准确的 DNA 互补链；该酶能够用 2‘， 3' -- 双脱氧核苷三磷酸作底 物并将其聚合到新生寡核苷酸链的 3‘ -末端，从而终止其延伸反应。
① 用 M13 噬菌体做载体获得单链 DNA 模板，克隆并扩增待测 DNA 片段，使其变性；
② 选择一条与 DNA 单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记； ③引物先同单链模板复性； ④在四个反应管中分别加入待测 DNA 单链模板、 互补引物分子、 四种的 dNTP 、DNA 聚合酶 (Klenow 酶 )以及不同 的 ddNTP ；
⑤进行聚合反应， DNA 新生链延长，当掺入 ddNTP 时，聚合反应终止； ⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳；
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⑦ 根据 X 底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出 DNA 序列。
45、 RAPD,SCAR ， SSR,AFLP 技术基本原理以及分子标记的应用领域有哪些，举例说明！ 1）基于 DNA -DNA 杂交（ southernblotting） 的标记
① RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphism（ 限制性片段长度多态性标记）
② VNTR:VariableNumberTandemRepeats（minisatellites） （可变数目串联重复序列标记） 2）基于 PCR （ PolymeraseChainReaction ）的标记 ① RAPD:RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA
应用短的“ DNA 寡核苷酸” （通常 10bp） 作引物，通过对基因组 DNA 随机扩增来检测 DNA 多态性的过程； 基本原理是通过随机引物在模板链的不同位置与基因组 DNA 结合，而结合位点在不同的品种不同，这样引物结合 位点和两结合位点之间的距离就会有差异，从而经过数次 PCR 循环产生 DNA 片段的多态性。
RAPD 技术的优点是：
自动化程度很高，操作简单，可为遗传图谱的建立提供大量的 RAPD 标记； 对于任意特定的引物可以用于不同基因组的分析，即该技术无物种特异性。
RAPD 分析方便快速，与 RFLP 相比，大大减少了前期的预备性工作；
RAPD 分析对 DNA 质量要求不高且 DNA 用量少。 缺点： PCR 对反应条件敏感，因此实验的重复性较差。 ② 序列特征化扩增） SCAR:SequenceCharacterizedAmplifiedRegions SCAR 标记是在 RAPD 技术的基础上发展起来的； RAPD 片段）进行克隆和测序； 基本原理是先做 RAPD 分析（如和目的基因连锁的
根据原 RAPD 片段两末端的序列设计引物（通常 20-24 个碱基），在进行 PCR 扩增，这样就可以把与原
RAPD 片 段相对应的单一位点鉴定出来，这样的位点称为
SCAR 标记。
③ SSR:SimpleSequenceRepeats（Microsatellites） （简单重复序列） 真核生物基因组中普遍存在着简单的重复序列如 （GA）n ，（AC）n ，（GAA）n 等，在染色体上呈随机分布，常连续重复 多次，在不同物种其重复序列及重复单位数都不同，但重复序列的两端往往是趋于保守；
利用某个微卫星 DNA 两端的保守序列设计一对特异引物，扩增这个位点的微卫星序列，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即 可显示不同基因型个体在这个 SSR 位点的多态性；
这种由保守序列确定的 SSR 可以检测出复等位的差异，常表现为共显性。
SSR 缺点是必须针对每个染色体座位的 SSR，测定并找到其两端的单拷贝序列设计引物操作复杂，劳动量大，这
些都是该技术目前在应用上的局限。
④ ISSR:Inter -simplesequencerepeat （简单序列重复间区） ⑤ DAF:DNAAmplificationFingerprinting （随机扩增多态性）
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⑥ AP -PCR:ArbitrarilyPrimedPolymeraseChainReaction ⑧ STS:SequenceTaggedSites （序列标签位点）
⑨ EST:ExpressedSequenceTag （表达序列标签） 3）基于 PCR 与限制性酶切技术结合的标记 ① AFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms （扩增片段长度多态性） AFLP 是 Zebeau （1993）等发明的一项技术，它的出现是 DNA 指纹技术的重大突破。 基本原理是基于 PCR 技术扩增基因组 DNA 的限制性片段。
具体过程是先将基因组 DNA 用可产生粘性末端的限制性内切酶消化产生大小不同的酶切片段，然后将含有共同粘 末端的人工接头连接到 DNA 片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点作为引物结合位点 根据需要通过选择在末端上分别增加了 1～3 个选择性核苷酸的不同引物，经过 PCR 反应选择性扩增限制性片段，
经过多次循环使目的序列扩增到 0.5-1.ug ，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上电泳，产生扩增片段 长度不同的多态性带型。
在 AFLP 引物中， 3'末端上选择核苷酸数目的多少决定了 AFLP 扩增产物的多少。 实验中可根据基因组 DNA 的大小确定引物末端所需的选择性核苷酸数目。
一般大于 l08bp 的基因组 DNA 可以用两个末端各有 3 个选择性核苷酸的引物进行扩增，即文献中常看到的 3+3 引 物组合； l05-l08bp 的基因组 DNA 可以用两个分别含有 2 个或 3 个选择性核苷酸的引物进行扩增 （即 2+3 引物 ）。 引物中用作选择性核苷酸的 G 和 C 含量也对扩增出的产物数目有较大影响。一般而言， G 和 C 含量越高，扩增出 的产物数目越少。
酶切片段要经过连续两次 PCR 扩增，通过两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好； 首先以酶切后连接产物作为模板， 用人工合成的选择性单链寡核苷酸作为引物进行预扩增。 预扩增目的为了减少选 择性碱基的错配，为选择性扩增提供更多的模板， 同时对模板起到选择性纯化的作用，从而使产生的指纹图谱具有 更好的重复性；
选择性扩增反应的条件与常规的 PCR 主要的不同之处是复性温度，其 PCR 开始于高温复性（ 65℃），比常规 PCR 反应的复性温度高 10℃左右，以获得最佳选择性，以后复性温度逐步降低，一直降到最佳选择性，以后复性温度 逐步降低，一直降到复性效果最好的温度（ 56℃），然后在这个复性温度下，完成其余 PCR 循环周期。 ② CAPS:CleavedAmplifiedPolymorphicSequences （扩增片段限制性酶切长度多态性） 分子标记的应用：亲缘关系和遗传距离分析。
①人类起源与迁移 :从分子系统发育水平上寻找非洲起源假说的证据。根据 120 个基因多态性数据作的进化树；根
据 mtDNA 多态性数据作的进化树；
②图谱定位重要基因 ③分子标记辅助选择：通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率，分 子标记辅助选择是现代分子生物学和传统育种学的结合点，分子标记可以在 DNA 水平上对育种材料进行选择
46、结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学、遗传图谱、物理图谱的概念 结构基因组学：研究基因组中基因序列信息和组成 功能基因组学：研究序列作用特性并用结构基因组学解释 比较基因组学：比较不同组织基因组内容、结构、组成 遗传图谱：提供大致相同位点的基因与其他位点已知基因的遗传关系 物理图谱：利用限制性内切酶将染色体切成片段， 再根据重叠序列把片段连接成染色体，确定遗传标志之间物理距 离的图谱
47、基因分离方法：同源序列法、基因组差示杂交法、基因标签法的技术原理
1）同源序列法： 根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离的基因可被用于制作分子探针，分离另一生物中的同源基因。 通过基因序列保守区设计出 PCR 引物，然后在 PCR 放大植物染色体 DNA 或
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cDNA ，在将获得 PCR 产物用做分 子探针，杂交筛选基因库，就可得到所要分离的基因。
2）基因组差示杂交法：
基因组差示杂交法是一种专门用于克隆那些由于 DNA 片断缺失而导致的变异的基因的方法。 首先用超声波处理变异植株基因组 DNA ，用生物素标记被超声波断裂的 DNA 片段。正常植物的基因 DNA 则用限 制性内切酶 sau3A 酶解。
用 6 倍过量的生物素标记的变异株 DNA 与 sau3A 酶解的正常植物基因组 DNA 进行杂交。 杂交液经含生物素的蛋白抗体处理后除去了两基因组中共同的 DNA 序列，保留了差别 DNA 片段 （即变异株中缺失 的 DNA 片段 ） ，重复上述杂交过程 2— 3 次，从而使得这差别 DNA 片段得到富集。
用 DNA 连接酶将一个人工设计的专门用作 PCR 引物模板的寡核苦酸片段 （adaptor） 连接到富集的差别 DNA 片段上。 用 PCR 法扩增这些 DNA 片段。然后用这些扩增的 DNA 片段作探针从基因库中筛选相应的基因克隆，这些对应的 克隆可用来分析和比较正常植株及变异株的基因组， 找到显示差别的克隆， 通过 RFLP 定位和序列分析及性状互补 实验最终确定所获的克隆是否对应于缺失变异的基因。
3）基因标签法：
利用外来的 DNA 片段随机的插入基因组中引起基因失活，如果外来 DNA 片断插入的位点正好处于某个基因内， 该基因的功能可能会丧失，产生易识别的突变表型鉴定未知基因的方法。通过分离转座子两侧宿主基因组 DNA 序 列，从文库中分离目的基因。常用基因标签系统： T-DNA 标签；转座子标签。
48、图位克隆法分离基因的技术流程以及原理 根据标记和基因在染色体上的位置，以分子标记定位，通过遗传和物理图谱逐步接近基因， 最后从文库中分离目标 基因; 需要大的分离群体精细定位。
49、常见转基因的方法 植物基因转化系统：
1）载体转化系统（ Ti 质粒转化载体、 Ri 质粒转化载体、病毒转化载体） 2） DNA 直接导入转化系统（原生质体、基因枪）
3）种质转化系统（花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊子房注射法） 。
载体转化系统是目前植物基因工程中使用最多、机理最清楚、技术最成熟的、最重要的一种转化系统 ,其中又以 Ti
质粒转化载体最为重要。 动物基因转化系统： 1） DNA 显微注射法 2）电击法
3）脂质体 （liposome） 法：应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。
4）反转录病毒法 5）胚胎干细胞法
6）精子载体导入法 50、农杆菌介导的遗传转化的原理 农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。 T-DNA 首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞， 并非整个 Ti 质粒都进入植物细胞。
1）T -DNA 的加工及转移： Vir 基因操纵子系统被活化后，在农杆菌中可测到单链 T-DNA（ssT-DNA ，亦称 T 链或
正链）。 T 链的形成取决于 VirD1 及 VirD2 两种蛋白，这些蛋白具有内切酶活性，在边界重复序列的特定位点形成 切口，产生单链断裂。
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2） T 链蛋白复合体的形成及 VirE 的功能 :T 链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜 及核膜，才能整合进植物基因内。在该过程中，Ｔ链必须避免被核酸降解，因此Ｔ链可能以一种 DNA - 蛋白复合体 形式存在。
3） T 链复合体的转运及 VirB 的功能 :T 链复合体至少包括 T 链 ,VirD2 及 VirE2 。VirD2 及 VirE2 可能已足以保护 Ｔ链并对Ｔ链的转运起导向作用；
Ｔ链的转运还需其它活性物质，活性物质可能是 VirB 蛋白。因为Ｔ链转运的第一步是通过细菌细胞膜，因此首先 必须形成跨膜孔道，需有跨膜或膜结合蛋白的参与。
4）T 链复合体靶向植物细胞核 :VirD2 及 VirE2 上有核定位信号 （nuclearlocalizingsignal, 简称 NLS） 。VirD2 Ｎ端 50% 已足以特异的剪切 T-DNA 的边界序列， C 端 50%则含 NLS；在 VirE2 中也有类似的序列，将其与 Gus 融合作为 报告基因，证明 virE2 可使融合蛋白导向植物细胞核； VirE2 与 VirD2 相比， VirE2 核定位功能较弱。 VirD2 可能 以一种极性方向，首先将 T 复合体定向至核孔，而 virE2 则作为一种促进因子，保证很长的 T 复合体在进入核孔 时不受干扰。
5）T 链整合植物基因组 :T -DNA 在植物染色体中的插入是随机的，插入位点常有以下特点： T-DNA 优先整合到转 录活跃的植物基因位点； T-DNA 与植物 DNA 连接处富含 A，T 碱基对；植物 DNA 上的插入靶位点与 T-DNA 边 界序列有一定程度的同源性。
51、转基因的证据
1）有严格的对照（受体种和阴性植株）
2）外源基因控制的表型性状证据 （如抗病、 抗虫等） :表型性状或筛选标记分析， 确定转基因植株具有了目标表型；
3）转化当代要提供 Southern 杂交、 Northern 杂交和 Western 杂交等物理数据， 以及酶活性分析或其它表型数据；
4）遗传证据。有性繁殖作物需有表型性状传递给后代的证据，无性繁殖作物需提供有性繁殖一代稳定遗传证据。
52、如何正确认识转基因及其涉及的伦理学问题！ 食品安全、环境安全、生物安全问题。
1）正确的伦理舆论导向 技术的双重性必然导致转基因技术的伦理争议，正所谓“真理越辩越明” ，适当的争论可以修正错误从而使技术的 负效应减少到最小，但是裹足不前甚至是恶意的争论不仅不利于科学技术的发展，更会为舆论带来错误的导向。这 就需要各领域的研究者秉持严谨的科学态度、正视争议的问题，用科学有理有据的事实材料证明观点。另一方面， 由于某些媒体的炒作， 对消费者的心理和转基因作物的产业化已经产生了很大的负面影响。 尽管科学界不断拿出种 种证据，以打消社会对转基因作物的疑虑。但由于转基因的一些机理尚不能完全被解释清楚，对转基因食品安全性 的担心有增无减， 很大程度上影响了这一技术的推广。 所以一个正确的伦理舆论导向的形成是技术良性发展的必要 前提。
2）社会的监督 技术的发展、应用与公众生活息息相关， 所以任何一项技术的发展都需要得到公众的理解和接受；任何一项技术的 使用都需要社会各界的监督。要实现公众的监督， 首先必须要让各界关心伦理的人发表意见，充分表达他们的合理 诉求，应当让人们通过充分的公共讨论，剔除那些非理性的、不客观的因素，使最终理性的决策结果通过人们的讨 论而达成共识。其次，政府需要对公众进行科学技术知识的普及，以确保公众能够产生科学的认识。最后，国家、 政府需为公众的监督提供多条途径， 创造条件让尽可能多的公民参与到讨论与监督中去。 使得有关于转基因技术的 决策能够在公共决策和专家、学者决策中趋于平衡。
3）加强监督管理和风险评估进一步完善相关的法律法规。我国的转基因技术发展迅猛，但是与之配套的法律法规 还尚待完善， 2001 年颁布的条例缺乏相应的效力并且遭到欧美等国家的指责，认为其缺乏合理性和可操作性，所 以加强对转基因农作物的监督管理、完善相应的法律还需有计划地制定和完善专门的生物技术安全条例，如： 转基 因技术安全管理条例；胚胎干细胞技术安全管理条例、人体基因技术管理条例等，使转基因技术在法律的框架下发 展，使转基因技术的应用有法可依、有章可循；其次建立严格完整的转基因产品检测和安全评价体系，虽然目前我 国的转基因技术比较先进，但是安全防范系统还比较落后，应加快完善安
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全保险体系、建立风险评估检测体系。严 格把好国内应用转基因技术这一关， 及时掌握技术发展及应用的动态并且严格检测进口的转基因食品， 防止国外有 害基因进入我国，造成污染、泛滥。
4）参与国外合作、借鉴国外管理办法转基因技术是全球性问题，这就需要加强国际间的合作，建立一个全球性的 生物安全防护系统，共同参与、研究、抵御外来物种入侵、传染的防治，在此过程中还可以借鉴他国有益经验和办 法，及时更新技术和管理；其次发达国家生物安全立法的模式主要有两种，一种是基于产品管理的美国模式，一种 是基于技术管理的欧盟模式。我国可以借鉴美国管理模式，由特定的管理机构管理，对转基因进行标注、检验，一 旦发现过敏、毒性、新成分等必须停止生产、销售；欧盟的管理就比较严格，欧盟分别针对转基因的技术和产品， 制定了相应的法律法规，并且规定对于含有转基因的必须加以标注并进行检测，并且实行审定和可溯源回收制度， 其中不仅涉及实验、生产、销售环节还涉及农用、餐桌、回收等都要一一进行标识，以确保基因的可追溯性。
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