不同来源黄芪的AFLP标记和代谢谱分析

不同来源黄芪的AFLP标记和代谢谱分析

姓名：周业庆申请学位级别：硕士专业：农业生物技术指导教师：潘大仁;漆小泉

20090401

福建农林大学硕上学位论文摘要黄芪是一种常用的中药，经过长期的人工栽培、杂交选育和自然选择已形成大量品种，然而来源复杂，品种混淆严重。本研究采用ＤＮＡ分子标记及代谢标识物鉴别相结合的分析技术，对不同来源的中药材黄芪进行区分，力求解决中药材黄芪遗传背景复杂、野生与栽培药材、不同产地药材的鉴别困难的问题。本论文有机结合现代分子标记技术及代谢组学最新研究技术，为中药材的鉴别提供新的思路和方法。１、采用ＡＦＬＰ技术对１９个不同产地的蒙古黄芪和膜荚黄芪进行分析。通过２８对引物的筛选，共选取了１ｌ对选择性扩增引物。对不同产地，不同品种黄芪进行选择性扩增，统计差异条带８５条。利用ＭＥＧＡ软件进行聚类分析，蒙古黄芪为一组，膜荚黄芪分了两组，基本能够将不同黄芪种质资源进行区分。不同产地的膜荚黄芪按地域分布集中，河北和山东产膜荚黄芪集中在一起，而２个吉林产膜荚黄芪较好集中在一起。而蒙古黄芪地域分布相对分散，野生黄芪聚类较好，但是有个别产地的蒙古黄芪聚类到膜荚黄芪中去。２、采用现代分析仪器（ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ）对不同米源黄芪脂相和水相代谢物分别进行代谢谱分析。利用ＣｈｒｏｍａＴＯＦ和ＸＣＭＳ（Ｒｐｌａｔｆｏｒｍ）软件对数据进行处理；用ＳＩＭＣＡ．Ｐ软件对进行规一化、中心化后，进行主成分分析（ＰＣＡ），偏最小二乘一判别分析（ＰＬＳ．ＤＡ），正交偏最小二乘一判别分析（ＯＰＬＳ）。结果表明，利用ＰＣＡ和ＰＬＳ对蒙古黄芪和膜荚黄芪脂相和水相分析，可以将两个黄芪品种区分开。对蒙古黄芪和膜荚黄芪脂相ＰＬＳ．ＤＡ分析得到ｌＯ种代谢标识物，对蒙古黄芪和膜荚黄芪水相ＰＬＳ分析得到１１种代谢标识物。不同产地的膜荚黄芪按地域分布集中，而蒙古黄芪地域分布相对分散。吉林四平和吉林通化的膜荚黄芪脂相非常接近，山东菏泽和河北保定的栽培膜荚黄芪脂相比较接近，甘肃漳县的野生膜荚黄芪水相、黑龙江鹤岗的野生膜荚黄芪水相与其它膜荚黄芪水相差异都非常显著。分子标记技术（ＡＦＬＰ）和ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ代谢组学技术，对１９个不同产地的蒙古黄芪和膜荚黄芪都能够区分开来，并且呈现一些地域分布特征，各个地域的膜荚黄芪都比较集中，地域差异比较明显，而各个地域蒙古黄芪的差异相对模糊，各个地域出现交叉。ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ代谢组学技术能够区分野生黄芪和栽培黄芪。综合比较，这两种分析结果趋于一致。关键词：黄芪，ＡＦＬＰ，ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳＩＩＩ福建农林大学硕士学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＡｓｔｒａｇａｌｕｓａｒｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄＣｈｉｎｅｓｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｒｏｕｇｈａｌｏｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｈｙｂｒｉｄｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｎａｔｕｒａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｈａｖｅａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓｐｅｃｉｅｓｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓ。Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｃｏｍｂｉｎｅＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓａｎｄ，．。ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｍａｒｋｅｒｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔｏｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈＡｓｔｒａｇａｌｕｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓｔｏｓｏｌｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ，ｂｅｃａｕｓｅｔｈｅｒｅａｒｅａｌｏｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＡｓｔｒａｇａｌｕｓ－ｂａｓｅｄｍｕｌｔｉ—ｓｐｅｃｉｅｓ，ｗｉｌｄａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｗｅｕｓｅｔｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｄｅｍｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｌａｔｅｓｔｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｔｏｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｉｄｅａａｎｄｍｅｔｈｏｄ．１．ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｉｔｈＡＦＬＰｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎａｌｙｚｅｓ１９ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｒｎｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．ａｎｄＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．Ｖａｔ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｇｅ．）Ｈｓｉａｏ．ＷｅｓｅｌｅｃｔＩ１ｏｎｅｓｆｒｏｍ２８ｐａｉｒｓｏｆｓｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｇｅｔｔｉｎｇ８５ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒｉｐｅｓ．ＭＥＧＡｓｏｆｔｗａｒｅｉｓｕｓｅｄｔｏｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ，ｗｈｉｃｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｓｔｈａｔＡ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓｉｓｉｎｏｎｅｇｒｏｕｐ，Ａ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓａｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ．Ｉｎｇｅｎｅｒａｌ，ｗｅｃｏｕｌｄｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｗＯｓｐｅｃｉｅｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｂｙｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄＨｅｂｅｉａｎｄＳｈａｎｄｏｎｇＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓａｒｅｔｏｇｅｔｈｅｒ，ａｎｄｔｈｅｔｗｏＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｏｆＪｉｌｉｎａｒｅｔｏｇｅｔｈｅｒ．Ａ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅｄ．Ｔｈｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｒｅｓｕｌｔｏｆｗｉｌｄｓｔｒａｇａｌｕｓｉｓｂｅｔｔｅｒ，ｂｕｔｓｏｍｅｏｆｔｈｅＡ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓｄｉｓｐｅｒｓｅｉｎｔｏＡ．．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ．２．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｕｓｅｍｏｄｅｍａｎａｌｙｔｉｃａｌｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＧＣ—ＴＯＦ／ＭＳ）ｔｏａｎａｌｙｚｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｏｆｌｉｐｉｄａｎｄｗａｔｅｒｐｈａｓｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓＡｓｔｒａｇａｌｕｓ．ＣｈｒｏｍａＴＯＦａｎｄＸＣＭＳ（Ｒａｒｅｕｓｅｄｆｏｒｄａｔａｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＡｆｔｅｒｓｃａｌｅａｎｄｃｅｎｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｂｙＳＩＭＣＡ—Ｐｓｏｆｔｗａｒｅ，ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ），ｐａｒｔｉａｌｌｅａｓｔｓｑｕａｒｅｓ·ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＬＳ·ＤＡ）ａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｐａｒｔｉａｌｌｅａｓｔｓｑｕａｒｅｓ—ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ（ＯＰＬＳ）ａｒｅｄｏｎｅ．ＩｔＣａｎｂｅｔｈｅｔｗｏＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓｂｙＰＣＡａｎｄＰＬＳａｎａｌｙｓｉｓ．Ｗｅａｎａｌｙｚｅｔｈｅｌｉｐｉｄ－ｐｈａｓｅｔｈｅｔｗｏＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓｕｓｉｎｇＰＬＳ－ＤＡ，ａｃｑｕｉｒｉｎｇ１０ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．ＷｅａｎａｌｙｚｅｔｈｅｗａｔｅｒｏｆｔｈｅｔｗｏＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓｕｓｉｎｇＰＬＳ，ａｃｑｕｉｒｉｎｇ１１ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｉｇｉｎｏｆＡ．ａｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｂｙｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｈｏｗｅｖｅｒ，Ａ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓｉｓｄｉｓｐｅｒｓｅｄ．Ｌｉｐｉｄｐｈａｓｅｏｆ彳．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｏｆＪｉｌｉｎＴｏｎｇｈｕａａｎｄＪｉｌｉｎＳｉｐｉｎｇｉｓｖｅｒｙｐｈａｓｅｏｆＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＨｅｂｅｉＢａｏｄｉｎｇａｎｄＳｈａｎｄｏｎｇＨｅｚｅｉｓｖｅｒｙＩＶｐｒｏｆｉｌｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍ）ｓｏｆｔｗａｒｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｏｆｐｈａｓｅｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｌｏｓｅｄ；ｌｉｐｉｄ福建农林大学硕士学位论文ｃｌｏｓｅｄ；ｗａｔｅｒｐｈａｓｅｏｆＧａｎｓｕＺｈａｎｇｘｉａｎｗｉｌｄＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓａｎｄｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｉＳｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｏｔｈｅｒＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ．ＩｔＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＨｅｇａｎｇｗｉｌｄＡ．Ｃａｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ１９ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｃｅｓｏｆｔｈｅＡ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓａｎｄＡ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｕｓｉｎｇＭｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＦＬＰ）ａｎｄＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳＭｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄｓｏｍｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｒｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ，．Ａ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｖａｒｉｏｕｓｗｉｌｄｇｅｏｇｒａｐｈｙａｒｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ，ａｎｄｉｔｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｓｐｅｃｉｅｓ．ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆＡ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｆｅｗ，ａｎｄｔｈｅｒｅｉｓａｃｒｏｓｓｂｅｔｗｅｅｎｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｓｐｅｃｉｅｓ．ＭｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳＡｓｔｒａｇａｌｕｓａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ．ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｗｏｂｅｔｗｅｅｎａｎａｌｙｓｅｓｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅａｒｅａｃｃｏｒｄａｎｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ，ＡＦＬＦ，ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳＶ独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。靴哔蚴黻储艴铭７№迎爷、醐：讲抄论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。口不保密，本论文属于不保密。∥学位。毕业，论文作者亲笔签名：７习婊日期：＆研／萨少指导教师亲笔签名。／日期：福建农林大学硕七学位论文第一章前言１黄芪概述１．１中药黄芪原植物的分类地位《中华人民共和国药典２００５年版一部》规定正品药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕａ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．ｖａｔ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｇｅ．）Ｈｓｉａｏ或膜荚黄芪Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．的干燥根‘¨。在分类地位上，黄芪位于豆科黄芪属黄芪亚属膜荚组，包含两个变种，一个变型，即原变种膜荚黄芪，变种蒙古黄芪，变型淡紫花黄芪Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．￡ｐｕｒｐｕｒｉｎｕｓｍＣ．Ｈｏ）Ｙ．Ｃ．Ｈｏ。有数据显示淡紫花黄芪与膜荚黄芪有同样的药用价值。值得注意的是《中华人民共和国药典》１９６３年版和１９７７年版中记载“黄芪为豆科植物膜荚黄芪（黄芪）Ａｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｕｎｇｅ或蒙古黄芪Ａ．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｕｎｇｅｖａｒ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｕｎｇｅ）Ｈｓｉａｏ的干燥根”。在之后的１９８５年版、１９９０年版、１９９５年版、２０００年版的《中国药典》中虽然仍为这１种１变种，但蒙古黄芪已置于黄芪（膜荚黄芪）之前。位置的颠倒，说明了黄芪原植物的主次之分‘纠。１．２膜荚黄芪和蒙古黄芪的形态膜荚黄芪形态：多年生草本，高５０．１００ｃｍ。主根肥厚，木质，常分枝，灰白色。茎直立，上部多分枝，有细棱，被白色柔毛。羽状复叶有１３．２７片小叶，长５．１０ｃｍ，叶柄长Ｏ．５．１ｃｍ：托叶离生，卵形，披针形或线状披针形，长４．１０ｍｍ，下面被白色柔毛或近无毛；小叶卵圆形或长圆状卵形，长７－３０ｍｍ，宽３．１２ｒａｍ，先端钝圆或微凹，具小尖头或不明显，基部圆形，上面绿色近无毛，下面被伏帖白色柔毛。总状花序稍密，有１０．２０朵花，总花梗与叶近等长或较长，至果期显著伸长：苞片线状披针形，长２－５ｍｍ，背面被白色柔毛；花梗氏３－４ｒａｍ，连同花序轴被棕色或黑色柔毛。小苞片２；花萼钟状，长５－７ｍｍ，外面被白色或黑色柔毛，有时萼筒近于无毛，仅萼齿有毛，萼齿短，三角形至钻形，长仅为萼筒的１／４．１／５：花冠黄色或淡黄色，旗瓣倒卵形，长１２．２０ｒａｍ，顶端微凹，基部具短瓣柄，翼瓣较旗瓣稍短，瓣片长圆形，基部具短耳，瓣柄较瓣片长约１．５倍，龙骨瓣与翼瓣近等长，瓣片半卵形，瓣柄较瓣片稍长；子房有柄，被细柔毛。荚果薄膜质，稍膨胀，半椭圆形，长２０．３０ｒａｍ，宽８．１２ｍｍ，顶端具刺尖，两面被白色或黑色细短柔毛。果茎超出萼外；种子３．８颗。花期６．８月，果期７－９月‘引。蒙古黄芪：植株较原变种矮小，小叶亦较小，长５．１０ｒａｍ，宽３－５ｒａｍ，荚果无毛Ｃ３］。福建农林大学硕士学位论文１．３膜荚黄芪、蒙古黄芪形态的多样性虽然膜荚黄芪，蒙古黄芪形态较稳定，但在野生和栽培群体及单株中仍存在许多变异类型．朱相云等发现在膜荚黄芪和蒙古黄芪野生和栽培居群中存在大量的淡紫花变异一旗瓣顶端淡紫色，膜荚黄芪中这种变异约为５０％，蒙古黄芪中约为５９．３％。这些变异类型常被误认为是淡紫花黄芪Ｈ１。谢小龙等在观察甘肃陇西栽培的蒙古黄芪群体时发现蒙古黄芪存在形态多样性，主要表现为叶片形态，叶片颜色，叶片生理反应，分枝形态，茎蔓颜色，花颜色，果荚颜色，种子颜色，种子花纹等形态的多样性［４，５１。１．４膜荚黄芪、蒙古黄芪形态与起源地生长环境的关系膜荚黄芪为中生植物。生于山地林缘、灌丛及疏林下。膜荚黄芪植株高大，茎直立、分枝少，叶较大，气孔密度大，栅栏组织细胞层少，与原产地较湿润、弱光的生长环境相适应。蒙古黄芪为旱中生植物。生于向阳草地及山坡，其低矮匍匐的株型，叶小，气孑Ｌ密度小，栅栏组织细胞层数多，花期早等特点与其原产地干旱，高光强，无霜期短的生长环境相适应‘２，们。２药用价值２．１黄芪医药效用黄芪为常用滋补中药材，己有２０００多年的应用历史，始载于东汉《神农本草经》，列为上品川。现代医学研究认为黄芪中的有效成分具有保护血管、心肌，改善患者血液流变性、促进血液正常运动，强心降压作用；对机体免疫调节作用，可以增强机体免疫功能，抗疲劳、抗肿瘤；具有提高抗御自由基攻击的能力、抗衰老的作用；具有保护肝脏、降低血清转氨酶的作用；对缺血性的肾脏有保护作用，有明显的利尿作用，改善脂肪及糖代谢，降血糖作用；抗病毒、镇静、镇痛等作用‘７，引。黄芬的临床应用范围较广，对治疗肺炎，肝炎毛㈨，慢性支气管炎，高血压，化脓性感染及先兆流产等疾病都有较好的疗效。另外与其它中药合用对治疗上呼吸道感染‘埘，沙眼［１１，１２］高血脂‘６１等疾病也有较好的效果，是中西医结合治疗中很有前途的药物。２．２化学成分研究黄芪的化学成分主要为多种黄酮类和三萜皂苷类化合物。另外还有单糖、多糖、氨基酸等。黄芪根中还含有香豆素、叶酸、苦味素、胆碱、甜菜碱、亚油酸、亚麻酸、香草酸、阿魏酸、异阿魏酸、对羟苯基丙烯酸、咖啡酸、绿原酸、棕搁酸、Ｂ．谷甾醇、胡萝ｂ苷、羽扇豆醇、正十六醇等成分㈣。主要制剂有归脾丸、龟鹿补肾丸、降糖丸、参茸白凤丸、补中益气丸、产复康颗粒等２２．３主要制剂福建农林大学硕士学位论文２２种丸剂、颗粒剂、片剂、口服液…及黄芪注射液等。３黄芪地理分布ｎ４１黄芪广布于我国东北、华北北部和内蒙高原草原东部，大致在东经１１００－１３００、北纬３４０－５７０范围内，北起大兴安岭山脉，南到河南中南部，西至鄂尔多斯高原。此外，在前苏联的东部、西伯利亚及远东地区、蒙古、朝鲜、日本也有分布。主产于山东、内蒙古及东北三省。山东以栖霞、招远、文登等地为多：内蒙古主产于额尔古纳左旗、喜桂图旗、赤峰等地；辽宁以凌源、建昌、北票、喀左等地为多；吉林主要分布于洮南、龙井、通化等地；黑龙江主产于杜尔伯特、大庆、林甸、龙江、甘南、齐齐哈尔、肇州、肇源、汤原、东宁及大兴安岭等地区。近年来，黄芪野生资源破坏严重，国内许多地区已对黄芬进行了引种栽培，如在山东、山西、河北、江苏等省均有大面积种植基地，栽培黄芪等已成为主要商品来源。４药用黄芪种质资源与分类研究现状在黄芪的代用品和民间惯用品中有许多种在有效成分等方面高于正品蒙古黄芪和膜荚黄芪，具有良好的资源开发价值。张庆芝等ｎ５１测定了云南民间惯用品黑毛多枝黄芪、斜茎黄芪、苦黄芪Ａ．ｋｉａｌｅｎｓｉｓ、梭果黄芪等的有效成分．黄芪甲苷、总黄酮和总多糖的含量，并与正品黄芪进行了对比。叶福嫒等‘１６１测定了金翼黄芪、梭果黄芪的氨基酸和微量元素含量，并与当地栽培的膜荚黄芪进行对比。饶伟文等ｎ７３测定了蒙古黄芪、膜荚黄芪、多序岩黄芪（红芪）、东俄洛黄芪、梭果黄芪、多花黄芪中的异黄酮类成分芒柄花素和毛蕊异黄酮，最终得出代用品东俄洛黄芪中的总异黄酮含量还高于正品膜荚黄芪。蒙古黄芪和膜荚黄芪作为药用资源，其种质资源与分类研究一直受到重视。在膜荚黄芪和蒙古黄芪中存在多个变异类群，他们形态上十分相似，难以区别，在分类上称为黄芪复合体（ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｐｅｎｄｕｌｉｆｌｏｒｕｓＬａｍ．Ｃｏｍｐｌｅｘ）。其中包括膜荚黄芪、蒙古黄芪、民和黄芪、淡紫花黄芪、Ａ．ｐｅｎｄｕｌｉｆｌｏｒｕｓ等。由于蒙古黄芪在形态、生物学特性、分布等方面的独特性和差异，许多研究者认为把蒙古黄芪上升为独立的种较为合适‘６，１睨们，而产于法国和意大利的Ａ．ｐｅｎｄｕｌｉｆｌｏｒｕｓ史刚荣等认为和膜荚黄芪同种异名，民和黄芪为膜荚黄芪种下的亚种似．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｓｐｐ．ｍｉｎｈｅｎｓｉｓ），淡紫花黄芪为膜荚黄芪的变种口．ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｖａｒ．ｐｕｒｐｕｒｉｎｕｓＹ．Ｃ．Ｈｏ）㈣。而朱相云等认为淡紫花黄芪作为膜荚黄芪下的亚种比较合适［４１０赵一之将产于蒙古高原北部及满洲里附近的蒙古黄芪变异类型定为新种北蒙古黄芪Ａ．ｂｏｒｅａｌｉｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓＹ．Ｚ．Ｚｈａｏ‘扪。５中药黄芪鉴别方法的研究进展黄芪经过长期的人工栽培、杂交选育和自然选择已形成大量品种，市场上除了正品黄芪３福建农林大学硕士学位论文外，尚有代用品、伪品和混淆品，品种混杂，质量差异较大；另一方面，随着育种亲本的集中化，育种中使用的材料越来越集中在一些优良品种或品系，使得所选育的新品种在更多的性状上更加相似而难以区分；生产上误用混杂、错误或不适当的品种必定会导致黄芪商品质量下降，临床疗效有较大差异。因此，关于黄芪的鉴别研究对于保障人们用药准确、安全、有效具有十分重要的意义。其鉴别方法可以分为经典方法和现代方法，现分述如下。５．１经典鉴别方法黄芪的经典鉴别方法是前人在长期的实践中总结和发展起来的，它不但能辨别黄芪的真伪，还可以判断黄芪药材的质量和地道性，方法简便、易行、迅速。主要包括来源性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别。（１）来源性状鉴别是指应用生物分类学的知识和方法，对中药的生物学来源进行鉴定；或者运用感官等直观的对中药的性状特征进行观察、鉴别。如观察黄芪的折断面，咀嚼等，这是中药黄芪鉴定工作的基础。谢开智吼１对正品黄芪和伪品黄芪的来源进行了描述。张杰咙１采用根类中药性状鉴别法，给出了正品黄芪与地区用药及伪品的鉴别方法。（２）理化鉴别是基于中药所含化学成分的某些理化性质对中药进行定性和定量分析，一般应用于性状相似而又无明显显微鉴别特征且化学成分不同的药材。由于正品黄芪即内蒙黄芪和膜膜荚黄芪均含有丫．氨基丁酸（有降压作用），和黄芪多糖（有免疫促进作用）通常作为理化鉴别重要依据㈨。（３）显微鉴别即利用显微镜来观察药材特征，用以鉴定药材真伪、纯度甚至质量。此方法通常可以应用于单凭性状不易识别、破碎或粉末状药材鉴别。王俊杰等‘２３１在电子显微镜下对蒙古黄芪和膜荚黄芪两种黄芪种子准确地做出鉴定。张海英以３通过显微鉴另ｌｊ方法对黄芪根横切面的观察，进行正品黄芪和多种伪品黄芪的鉴别。中药的经典鉴别方法主观性和经验依赖性较强，基源鉴别、性状鉴别和显微鉴别具有一定的实用价值，但这些方法在指标性成分鉴别方面具有明显的局限性。理化鉴别一般只反映个别活性成分的含量，忽略了中药材诸多成分间的协同作用，因而不能完全反映药材质量的好坏。中药的防病治病源于其所含的各种活性成分，鉴别方法需要基于物质成分的表征和分析才能体现出中药的内在质量。因此，借助先进的科学仪器和手段用于中药鉴别已成为中药鉴别领域的研究热点‘２副。４福建农林大学硕士学位论文５．２现代鉴别方法目前可用于中药黄芪鉴别的现代鉴别方法可概括为分子生物学方法和代谢组学技术两大类。５．２．１分子生物学方法随着现代分子生物学的迅猛发展，分子生物学方法已在农、林、医学及动、植物和微生物学的各个领域得到了广泛应用。目前，用于中药黄芪鉴别的分子生物学方法主要有：ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ。５．２．１．１ＡＦＬＰ技术ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）技术是１９９５年由荷兰Ｋｅｙｇｅｎｅ公司科学家ＺａｂｅａｕＭａｒｃ和ＶｏｓＰｉｅｔｅｒ发明创建的一种ＤＮＡ分子标记新技术‘２６１。是一种选择性扩增限制性片段的方法，其实质是ＲＦＬＰ（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）和ＤＮＡ）相结合的一种产物［２７］ｏ（１）ＡＦＬＰ的原理ＡＦＬＰ技术是基于对基冈组总ＤＮＡ双酶切经ＰＣＲ扩增后的限制性片段进行选择‘２８‘３０１具体是植物基因组ＤＮＡ经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段．将特定的接头（ａｄａｐｔｅｒ）：ｋ奎接在这些ＤＮＡ片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和ＰＣＲ引物３味端的识别，特异性片段经变性，退火和延伸周期性循环而扩增，最终通过聚丙烯酸胺凝胶电泳分子筛的作用，将这些特异的限制性片段分离开来。（２）ＡＦＬＰ流程包括模板准备、片段扩增和凝胶分析这３个主要步骤眺珈１各步骤具休的过程有：（１）提取样本的基因组ＤＮＡ经浓度和质量检测后，根据基因组特点选择６个碱基识别位点的限制性内切酶，通常是ＥｃｏＲｉ或ＰＳＩＴ或Ｓａｄ，和４个碱基识别位点的限制性内切酶，通常是Ｍｓｅｌ或Ｓｓｅｌ在适宜的缓冲系统中进行酶切。（２）酶切后的限制性片段在Ｔ４连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。（３）ＰＣＲ预扩增。（４）选择性扩增。（５）ＰＣＲ产物变性后在含尿素的聚丙烯胺变性胶上电泳。（３）ＡＦＬＰ标记技术具有以下几个优点它不仅具备了其它ＤＮＡ分子标记技术所具有的特点，多态性丰富，共显性表达，不受环境影响，无复等位效应，而且还具有带纹丰富，用样量少，灵敏度高，快速高效等特殊优点。（１）ＤＮＡ用量少，０．ＳｍｇＤＮＡ样品，可做４０００个反应；（２）效率高且简单，ＡＦＬＰ一次选择扩增就能比较几十甚至上百个位；（３）分辨率高，ＡＦＬＰ扩增片段短，片段多态性检出率Ｓ福建农林大学硕士学位论文高；（４）可靠性好，由于ＡＦＬＰ是特定引物扩增，退火温度高，假阳性低，重复性好，克服了ＲＡＰＤ的缺点；（５）不需要Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，不需要预先知道ＤＮＡ的序列信息‘３１１正是基于上述优点，该标记技术被认为是一种有效和先进的分子标记，现已广泛遗传图谱构建、分子标记辅助选择育种、遗传多样性和种质资源鉴定、基因表达因克隆等方面‘３２·川。（４）ＡＦＬＰ标记在药用植物研究中的应用前景ＡＦＬＰ分子标记技术是ＲＡＰＤ标记和ＲＦＬＰ标记相结合的结果，既有ＲＦＬＰ标记的可靠性，也具有ＲＡＰＤ标记的方便性。ＡＦＬＰ技术自创建以来，作为一种重复性好、分辨力高的ＤＮＡ标记方法被应用于生命科学的多个领域，尤其是在生物分类、育种、病原诊断、流行病学研究方面应用广泛。近年来，随着其技术的不断改进和完善，使该方法更加省时、方便、易于操作，其应用范围也不断扩展，特别是在品系分析和品种鉴定研究中的应用使研究者们看到了其广阔的应用前景，ＡＦＬＰ技术将成为品系分析和品种鉴定研究的一种有力工具，近年来在药用植物遗传分析的各个方面，如分类、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因的定位等表现出良好的发展前景。遗传连锁图谱的构建遗传图谱是作物资源研究、育种及分子克隆的理论依据和基础。在药用植物研究中尚不多见。在８０年代前，大多数作物还没有一个完整的遗传连锁图哪！。分子标记的快速发展大大促进了遗传连锁图谱的构建，为系统研究基因组信息奠定了良好的基础。目前用于遗传图谱构建的分子标记主要有ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ等。用ＡＦＬＰ技术可以扩增染色体末端标记，填充空隙，其多态性产物中，可以定位于图谱上的比例相当高．故非常适合于构建高密度的分子遗传连锁图谱。Ｄｅｂｅｎｅｒ和ＭａｔｔｉｅｓｃｈＣ３６１利用ＲＡＰＤ和ＡＦＬＰ标记技术构建了玫瑰的分子遗传连锁图谱。Ｈａ．ｙａｓｈｉ等Ⅲ１采用ＡＦＬＰ和ＲＡＰＤ标记技术构建了日本松的分子遗传连锁图谱。王竹林等‘３８１构建了含１００个ＳＳＲ标记（９１个引物）和５８个ＡＦＬＰ标记（１２个引物）的小麦遗传连锁图。随着对ＡＦＬＰ分子标记研究的不断深入，其在药用植物遗传连锁图谱的构建中也将有着广阔的前景。亲缘关系和遗传多样性研究遗传多样性是种内所有生物个体的全部基因和染色体变异的总和嘟１ＡＦＬＰ标记是进行种质亲缘关系分析和检测种质多样性的有效工具，可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定亲本间遗传距离，并进而划分杂交优势，提高杂种优势潜力。ＡＦＬＰ现已广泛用于植物的遗传多样性研究，近年来利用ＡＦＬＰ标记对药用植物种质资６福建农林大学硕士学位论文源遗传多样性的研究也呈逐渐增多趋势。张磊等‘３９１利用ＡＦＬＰ分子标记技术研究了中国红花２８个不同栽培居群在ＤＮＡ水平的多态性，发现红花种内存在一定的遗传多样性，为进一步进行红花种质资源选育和筛选质量相关基因奠定了基础。闫志峰等‘４０１对来自１０个野生种群共计１２９个黄檗个体进行了ＡＦＩＰ分析。王利等‘４¨对２１个银杏观赏品种的遗传关系进行了ＡＦＬＰ标记研究，确定了“塔形银杏”等８个特异种质。种质资源鉴定种质资源（ｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）是农业上作物育种学经常使用的术语，亲代传给子代的遗传物质称种质，携带各种种质的材料称种质资源，又称遗传资源或基因资源【３５１。种质资源是基因的载体，植物种内所有个体及其遗传性状的基因构成了该物种的基因库（ｇｅｎｅｐ００１），其中可能蕴藏着丰富的已知或未知的有益基因‘捌，如控制高产、抗病、抗逆等优良性状的基因和控制有效成分代谢途径和代谢速度的基因。用传统的田间表型性状进行鉴定，从种质资源中发现有益基因甚少。而同工酶与蛋白质标记易受外界环境因素影响，结果并不稳定。ＡＦＬＰ标记技术的迅速发展，有助于探明种质资源的遗传背景和亲缘关系，从而为药用植物种质资源的分析与评价提供分子水平上的理论依据。马小军等‘４３３对大马牙、二马牙、长脖、圆膀圆芦和黄果等５种人参农家类型ＡＦＬＰ图谱进行研究，所有类型均有特异条带可作为鉴别特征。杜娟等‘“３选择全国ｌＯ个主要产地的野生或栽培半夏为材料，采用ＡＦＬＰ方法研究，并进行聚类分析，为半夏种质资源鉴定和亲缘关系研究提供了分子生物学依据。唐晓清等Ｈ５１对丹参不同农家栽培类型进行了ＡＦＬＰ分析，结果表明ＡＦＬＰ技术可以作为鉴别丹参种内不同栽培类型间遗传差异的手段。分子标记辅助育种与基因定位传统遗传育种与现代分子生物学相结合的分子标记辅助育种，可在ＤＮＡ水平上对育种材料进行选择，从而高效改良作物的产量、质量和抗性等综合性状。ＡＦＬＰ技术有助于克服早期选择亲本基因组的盲目性。Ｖａｎｔｏａｉ等‘４６１利用ＡＦＬＰ研究了大豆轮回交选择过程中，亲本基因组ＤＮＡ对于子代的贡献，其结果发现，经过两次轮回选择，２个适应性亲本在后代的基因组中占７５％，而４个外地品种只占后代基因组成分的２５％。此试验表明，根据ＡＦＬＰ标记可以进行轮同选择，可以跟踪基因的转移情况，如果ＡＦＬＰ标记与要选择的基因紧密连锁，这样就可以在早期筛选植物分离群体中分离出含目的基因的植株。这也为我们筛选与药用植物优良性状有关的目的基冈提供了依据。此外，对来自地道产区和非地道产区的同一品种进行ＡＦＬＰ分析，将是挖掘··地道基因，，的行之有效的方法ｍ１。７福建农林大学硕士学位论文５．２．１．Ｚ叠Ｉｌｉ’ＬＰｌ江ＬＰ全称为限制性片段长度多态性（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）啪１。它是指一个物种的ＤＮＡ被某种特定的限制性内切酶消化所产生的ＤＮＡ片段长度的变异性。ＲＦＬＰ被广泛地应用于玉米、小麦、水稻等１０多种植物进行遗传图谱的构建，并进入利用ＲＦＬＰ进行基因定位的阶段。５．２．１．３ＲＡＰＤＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）是从ＲＦＬＰ之后发展起来的一种新的ＤＮＡ多；态性检测技术。ＲＡＰＤ是由美国的Ｗｉｌｌｉａｍｓ‘４９１几乎同时提出的一种分子标记技术，它以一系列不同的随机排列的碱基顺序的寡核苷酸单链为引物，然后对所研究的基因组ＤＮＡ进行单引物扩增，扩增出来的ＤＮＡ片段的多态性就反映了基因组相应区域的ＤＮＡ的多态性。ＲＡＰＤ是以ＰＣＲ为基础，扩增产物（虽Ｉ］ＤＮＡ片段）通过琼脂糖凝胶电泳后得到电泳图谱，根据图谱给出的ＤＮＡ多态性信息进行中药的分类和鉴定嘞１。具有检测效率高，样品用量少，灵敏度高，检测方便容易等优点。目前ＲＡＰＤ方法正广泛应用于动植物遗传育种、居群遗传学、生物系统学与进化等研究嘲１。目前应用现代分子标记技术研究黄芪遗传多样性及亲缘关系的还比较少，目前见报道的也是以ＲＡＰＤ技术应用较多。ＮａＨＪ等哑１应用ＲＡＰＤ技术在ＤＮＡ分子水平上对中国产和韩国产黄芪进行鉴别，证明不同产地黄芪的基因多态性，为黄芪的产地鉴别提供参考。ＰｕｉＹｉｎｇＹｉｐ等‘５３１首先利用ＰＣＲ技术对ｒＲＮＡ基因的内转录间隔区（ｉｎｔｅｍａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｌ，ＩＴＳｌ）进行扩增，对ＰＣＲ扩增产物进行ＤＮＡ测序以确定黄芪的种类。然后利用任意引物聚合酶链反应（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙｐｒｉｍｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＡＰ．ＰＣＲ）技术对黄芪的产地进行鉴别。结果表明黑龙江产黄芪与内蒙古、山西产黄芪有明显的区别，而内蒙古和山西产黄芪的差别很小。张曦等‘５４３分别构建了黄芪和其近缘属植物红芪ＤＮＡ指纹图谱，利用ＲＡＰＤ标记方法分析黄芪和红芪之间具有明显的ＤＮＡ谱带差异。这些差异可以准确地鉴别黄芪和红芪。吴松权等嘟１应用ＲＡＰＤ技术对黄芪的１４个材料进行了亲缘关系分析。结果表明，从１００个随机引物中筛选出１３个引物共扩增到１８０条清晰可用的带，其中包括１６９条多态性带，多态性比率高达９３．９％。聚类分析结果表明，供试材料可分为膜荚黄芪和蒙古黄芪两大类，与传统的分类结果一致，证明ＲＡＰＤ标记可用于黄芪种和变种之间的鉴定。５．２．１．４ＳＳＲｓｓＲ全称为简单序列长度多态性标记，是ＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＳｉｍｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｐｅａｔ，ＳＳＲ的简写，也称为微卫星，是由ｌ～６个碱基组成的基序（ｍｏｔｉ０串联重复而成的短片段，例如８福建农林大学硕士学位论文（ＣＡ）ｎ，（ＧＡＴＡ）ｎ等，长度一般小于ｌｏｏｂｐ。ｍＺｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ－等‘矧建立的一种新型分子标记技术。已经证明，真核生物的基因组中散布着大量的串联重复序列，它们具有丰富的多态性，并能按门德尔规律稳定地遗传与分离［５７，５８］。微卫星在真核生物中广泛的存在，据研究报导，真核生物中大约每隔１０＂＇５０个ｋｂ就存在一个微卫星。微卫星标记是一种共显性标记，因而简化了遗传分析的过程。微卫星标记也是一种基于ＰＣＲ的标记，因此使得它相对于ＲＦＬＰ来说，操作上更为简洁快速，除此之外，微卫星标记作为一种ＳＴＳ标记也便于从遗传图谱向物理图谱过度。５．２．２代谢组学技术５．２．２．１代谢组学的概念代谢组学是对生物或细胞内所有低相对分子质量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科‘５９】。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以生物标记物（ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）和物标记模式（ｂｉｏｍａｒｋｅｒｐａｔｔｅｍ）的发现、信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支。代谢组学实质上是一种采用系统生物学思路进行研究代谢小分子组的一种高通量的分析方法，是研究生物体系代谢途径的新技术。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ最初给出的定义是：定量测量生物体因病理生理刺激或基因改变引起的代谢应答变化ｍ６１】，系统性的代谢组学概念应将机体的代谢过程与微生物代谢以及外源环境因子的相互作用因素综合起来‘６２１。５．２．２．２代谢组学的研究内容主要包括：（１）代谢物靶标分析（ｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｓｉｓ），针对某种或某～组特定代谢产物进行分析：（２）代谢产物谱分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇ），对某一类结构、性质相关的化学物，或某一代谢途径的特定代谢物进行定量分析；（３）代谢产物指纹分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ），对代谢产物进行高通量的定性分析，而往往不进行定量分析；（４）代谢组学分析（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ），对某一生物或细胞所有小分子量代谢产物进行的定性和定量分析；（５）代谢表型分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ），对某一生物或细胞的代谢产物进行定性和定量分析，根据代谢产物来对有关生物或细胞进行分类和鉴定【６３】。５．２．２．３代谢组学的技术平台‘６４Ｊ代谢组学主要研究作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物。研究大致分为３个阶段：样品制备，代谢产物检测、分析与鉴定以及后期数据分析和模型建立。代谢组学所分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其它物理化学参数差异很大，单一的分离分析手段往往难以保证无偏向的全面分析。色谱、质谱、核磁共振波谱、红外光谱、原子光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手Ｏ福建农林大学硕士学位论文段及其组合都应用于代谢组学的研究，一般根据样品的特性和实验目的，选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段是气相色谱和质谱联用（ＧＣ／ＭＳ），液相色谱和质谱联用（ＬＣ／ＭＳ），核磁共振（ＮＭＲ）及傅里叶变换红外光谱与质谱联用（ＦＴＩＲ／ＭＳ）。５．２．２．４代谢组学分析技术的进展代谢组学分析系整体性地定性分析样品，比较图谱的差异，借助现代化学计量软件快速鉴别和分类【６５１，以下是目前常见的几种代谢组学分析技术。（１）核磁共振技术１９９９年Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎｔ［６０】首次提出以ＮＭＲ分析为主的代谢组学研究模式。ＮＭＲ是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。Ｄｕｍａｓ等㈣利用１Ｈ．１３Ｃ．ＨＭＢＣ－ＮＭＲ技术成功地检测分析了内源性物质的代谢产物。秦海林等人在十几年从事ＮＭＲ指纹图谱对中药鉴定的研究中有了很大进展［６７，６８】，对人参、天麻、黄连、虎杖、何首乌和掌叶大黄、唐古特大黄等中药材分别进行了充分的研究，取得了较好的成果。代谢组学中ＮＭＲ方法的特点如下【叫：（１）不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤；（２）可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，在接近生理条件下进行实验；（３）可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程，给出极其丰富的有关动态特性的信息；（４）可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样；（５）无偏向性，对所有化合物的灵敏度是一样的。（２）质谱技术质谱法是利用离子化技术，将物质分子转化为离子，按其质荷比（ｍ／ｚ）的差异分离测定，从而进行物质成分和结构分析的方法。代谢组学关心的是小分子量的代谢产物，由于质谱具有快速、高灵敏度、选择性定性定量、可识别代谢物和可测量多种代谢物等性质，并且ＭＳ能有效的与各种色谱法在线联用，成为分析复杂体系的有力手段。近年，随着质谱及其联用技术的发展，新一代ＭＳ也开始在代谢组学研究和代谢通量分析中倍受青睐。袁湘林‘７０１以２，５．二羟基苯甲酸为基体采用基体辅助激光解吸电离时间飞行质谱（ｍａｔｒｉｘ．ａｓｓｉｓｔｅｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ．ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｌａｓｅｒｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ．ＭＳ）对不同产地的黄芪进行质谱分析，比较质谱图，找出黄芪的指纹峰，通过指纹峰和专属性较强的质谱峰判断黄芪的真伪。同样基于飞行时间Ｑ—ＴＯＦ．ＭＳ能高通量分析水溶性化合物，大量用于代谢组学研究［７１］（３）色谱技术采用各种色谱整体性地分析复杂中药体系的次生代谢产物，还只是中医药现代化研究１０福建农林大学硕士学位论文的起点。这种方法首次强调从整体和系统的角度看待中药，采用各种色谱高通量、整体性地分析复杂中药体系的次生代谢产物，即通过比较色谱指纹图谱的异同并进行模式识别分析，以区分鉴定中药材并控制质量‘７２１，为理清中药复杂体系的化学基础打下了良好的基础。实际上，这本身就是一种代谢组学的研究方法【７３】。薄层色谱分析法具有快速、经济、可靠、操作简单、适用范围广的特点目前广泛应用于多基源品种、含同一成分的不同植物（药材）的鉴别。目前中国药典２００５版中仍然采用此法对黄芪进行鉴定。孙捷等＂４１采用薄层色谱法对正品和伪品黄芪注射液进行鉴别。金芳等＂５３采用薄层色谱法对膜荚黄芪和蒙古黄芪进行鉴别分析。用气相色谱法（Ｇｃ）所获得的色谱图谱，其重现性、分辨率相对较好，提供的信息量大，操作简便，样品只需简单化学处理，而且由于是封闭系统色谱，外界的影响因素较少，稳定性较好，检测设备的可选性较大，特别适合于挥发性药材及制剂的鉴别和含量测定。周枝风等对中药材白术挥发油指纹图谱做了研究【７６】。洪筱坤、王智华等建立了柴胡［７７３檀香‘７８１及麝香‘７９３的气相色谱相对保留值指纹图谱（Ｇｃ．ＦＰＳ）。高效相色谱方法具有稳定性好、柱效高、应用范围广等特点，是中药指纹图谱研究的常用手段。ＭａＸＱ等嘞１将正品黄芪与八种近缘属植物的ＨＰＬｃ指纹图谱比较分析，为中药黄芪的鉴别提供了方法和依据。赵健雄等腿¨采用高效液相色谱法研究黄芪和红芪的指纹图谱，结果在同样的色谱条件下，黄芪与红芪的图谱和指标成分的含量有明显差别。（４）分析技术联用质谱技术的高灵敏度和特异性（ＭＳ／ＭＳ联用还有结构鉴定能力），配合色谱技术（Ｇ－Ｃ、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ和ＣＥ）卓越的分离性能，在代谢组学研究应用中显示出极大的潜力。因此，越来越多的学者将色谱质谱联用技术用于代谢组学的研究‘８２１。基于质谱技术的联用分析方法主要有Ｌｃ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、毛细管电泳质谱联用（ＣＥ／ＭＳ）。ＭＳ与各种色谱技术联用使它在药物代谢组学的研究中扮演着十分重要的角色。高效液相色谱一质谱（ＨＰＬＣ．ＭＳ）是现代仪器分析中最常用的联用技术，它集液相色谱的高分离效能与质谱的强鉴定能力于一体，不仅有足够的灵敏度、选择性，同时还能够给出一定的结构信息，分析快速且方便等优点。此外，还有ＨＰＬＣ．ＤＡＤ．ＥＬＳＤｇ）｛用方法［８３１。ＬｉｎＬＺＥ８４］报导了利ｇ］ＬＣ．ＥＳＩ．ＭＳ技术对蒙古黄芪和膜荚黄芪中黄酮类成分进行比较和鉴定；ｘｕＱ‘８５１等对黄芪提取物的皂苷类成分建立了ＨＰＬＣ．ＭＳ方法，分离和鉴定了１２个黄芪皂苷类化合物，该方法可以用于不同产地来源的黄芪药材鉴别。ＱｉＬＷ等嗵３１基于ＨＰＬＣ．ＤＡＤ．ＥＬＳＤ方法，对来自不同地区的１１个黄芪样品的六种异黄酮类成分和四种皂苷类成分同时进行测定和比较，这些方法无疑为鉴别黄芪种属和产地提供了科学依据。１１福建农林大学硕士学位论文Ｐｌｕｍｂ等［８６，８７］Ｊ毛Ｊ液相色谱和飞行时间质谱（ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ）联用技术，在事先不清楚受试药物结构的情况下检测了体液中的药物代谢产物，结合化学计量学的方法对比分析给药样本与空白样本的谱图，在复杂谱峰中分出了代谢产物的质谱峰，避开了大量内源性物质的干扰。此外，Ｈａｒａｄａ等㈣研制了一种非常适用于代谢分析的以毛细管电泳与质谱联用为基础的方法，此方法利用压力辅助毛细管电泳和电喷雾电离质谱（ＰＡＣＥ／ＥＳＩ－ＭＳ），能同时分析磷酸糖、有机酸、核苷酸和辅酶Ａ化合物等阴离子代谢产物。由此可见，多种分析技术联用在药物代谢组学的研究中起着多么重要的作用。气质联用（ＧＣ．ＭＳ）气相色谱和质谱联用仪（ＧＣ／ＭＳ）分析时，首先需对样品进行衍生化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）处理，来增加样品的稳定性和挥发性，以利于用气相色谱和质谱联用仪（ＧＣ／ＭＳ）ｑ甘的气相色谱仪进行分离。接着，质谱仪可以对气相色谱中的每一个峰以１秒的间隔进行扫描，获得每个峰的质谱图。每个峰所代表的化合物的分子结构可以通过其碎片峰的类型和质荷Ｌ匕（ｍ／ｚ值）结合有关质谱数据库来进行鉴定，其含量可以通过峰面积的大小来定量。质谱数据库可以是自己建立的，也可以是商业化的质谱库（如Ｗｉｌｅｙ和ＮＩＳＴ质谱库）。虽然商业化的质谱库包含２５００００多种化合物，但许多不常见的初生代谢产物却没有被包括。目前，植物提取物ＧＣ／ＭＳ色谱图中通常有近７０％的峰仍然无法得到鉴定。ＧＣ／ＭＳ分离时对毛细管柱梯度加热，根据挥发性高低、在毛细管中保留时问不同达到分离的目的。ＧＣ／ＭＳ特长是分析挥发性物质，而对于难挥发物质较难分析。含有．ＣＯＯＨ、．ＯＨ、－ＮＨ和．ＳＨ等功能基团的难挥发物质还可以通过衍生化（烷基化、酰化、硅烷化）后降低其气化温度实现分离‘８９１。质谱的检测方法主要有电子离子质谱［Ｅｌ（Ｍｓ）］和ＴＯＦ（ＭＳ）。后者获取数据的速度快，对质荷比的分辨率高。ＧＣ柱长更短、内径更小的毛细管柱可以大大减少样品分析时间（从４０ｍｉｎ减少至ｌＯｍｉｎ）ｔ矧。采用ＧＣ．ＭＳ可以同时测定几百个化学性质不同的化合物，包括有机酸、大多数氨基酸、糖、糖醇、芳胺和脂肪酸【９ｌ】。Ｆｉｅｈｎ等嘲用ＧＣ．ＭＳ从植物叶的提取物中自动匹配／蛊３２６个化合物，然后用代谢轮廓鉴别４种不同基因型的植物。利用ＧＣ／ＭＳ，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒｄ、组对拟南芥叶片和马铃薯块茎极性和亲脂性的提取物中的３２６种代谢产物进行了定量，鉴定出了其中一半化合物的结构‘９３１。基于飞行时间检测器的ＧＣ－ＴＯＦ．ＭＳ能进行快速扫描，具有高通量、分辨率及高灵敏度的特性，为现今最先进的气质联用仪，非常适用于大通量代谢指纹分析及代谢谱库的构建，采用二级色谱法（Ｇｃ．Ｇｃ）还可以实现更高的分离效率‘９４１。阿基业【删等应用ＧＣ／ＴＯＦ（ＭＳ）濒］定了３０个正常人的血浆代谢组，该分析方法联合多变量分析工具ＰＣＡ和ＰＬＳ可以解析５０１个１２福建农林大学硕士学位论文峰，从方法学证实了ＧＣ／ＭＳ可用于人血浆研究代谢组学。Ｏ’Ｈａｇａｎ［９６１等建立二级色谱质谱Ｉ渊［ＧＣ．ＧＣ厂ｒＯＦ（ＭＳ）］测定人血清代谢组学的方法。该方法可以检测出４０００多个峰，信噪比高于５的峰可以检测出１８００多个，约为一级ＧＣ的３倍。ＧＣ／ＭＳ被用于研究先天性代谢疾病的筛选和莱．萘二氏综合征［９７，９８】。６数据分析方法介绍代谢组学研究产生大量的资料需要进行提取、峰对齐、去噪等处理，然后通过模式识别和多维统计分析等方法对资料分析，才能从海量的数据中获得所需要的信息。常用的数据分析方法可分为非监督和有监督方法∽１。６．１非监督方法（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｍｅｔｈｏｄ）按样本特性对原始数据分类，把具有相似特性的数据归为一类，将得到的分类信息和这些样本的原始信息进行比较，用相应的可视化技术表达结果，建立代谢产物与这些原始信息的联系，筛选与原始信息相关的标记物，进而考察其中的代谢途径。包括主要成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）、非线性映像（ＮｏｎｌｉｎｅａｒＭａｐｉｎｇ，ＮＬＭ）、聚类分析（ＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＣｌｕｓｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓ，ＨＣＡ）。其中应用最多的ＰＣＡ是一种高纬数据降纬的方法，将分散在一组变量的信息集中到某几个综合指标（主要成分）上，从而利用主要成分提取数据集的特征。主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）主成分分析可以看成是数据综合方法。通过对原始数据变量的线性组合，可以得到相互正交的新的特征变量（即主成分）。这些变量能够最大限度的保留原始样本集的数据信息，可以用于中药的鉴别研究。Ｙｏｕｎｇ—ＡｈＷｏｏ等‘１００３首先采用近红外光谱结合主成分分析（ＰＣＡ）模式识别技术对４６种中国产黄芪和５１种韩国产黄芪进行产地鉴别。前三个主成分ＰＣＡ得分图显示黄芪分成两类，并与其实际产地一致。６．２有监督方法（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｍｅｔｈｏｄ）在已有知识的基础上建立信息组。利用己知信息组对未知数据进行归类、识别和预测。因为建立模型时有已知样本，所以称有监督方法。主要有类模拟软独立建模（ＳｏｆｔＭｏｄｅｌｉｎｇｏｆＣｌａｓｓＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＡｎａｌｏｇｙ，ＳＩＭＣＡ）、偏最小二乘法（ｐａｒｔｉａｌｌｅａｓｔｓｑｕａｒｅｓ，ＰＬＳ）、人工神经网络（ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＮｅｕｒａｌＮｅｔｗｏｒｋ，ＡＮＮ）、典型判别分析（Ｄｉｓｅｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ）等。其中ＳＩＭＣＡ—Ｐ软件可进行ＰＣＡ、ＰＬＳ等分析。ＳＩＭＣＡ（ＳｏｆｔＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＭｏｄｅｌｉｎｇｏｆＣｌａｓｓＡｎａｌｏｇｙ）方法ＳＩＭＣＡ是由瑞典学者Ｓ．Ｗｏｌｄ提出，是基于类模型基础上的有监督的模式识别方法‘１０¨。由于同一类样本具有相似的特征，在一定的特征空间内就会聚集在一起，而不同类的样本则分布在不同的区域。通过１３福建农林大学硕士学位论文主成分分析分别针对训练集中的每类样本建立类模型。然后对实验集中的样本，计算其到各类模型的Ｓ１ＭＣＡ距离，根据ｓ姒ｃＡ距离判别该实验样本的类别‘１吲。史春香学１０３１运用ＳＩＭＣＡ方法建立了不同产地黄芪的判别分析模型，研究结果表明，建立的模型合理，具有优良的鉴别分类功能。偏最ｄ，＿－－乘判别分析（ＰａｒｔｉａｌＬｅａｓｔＳｑｕａｒｅ．ＤｉｓｅｒｉｍｉｎａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ，ＰＬＳ—ＤＡ）ＰＬＳ－ＤＡ是一种线性回归方法，多元变量相应的观测值与样本的类别相关，这种方法是有监督分类，ＰＬＳ．ＤＡ方法用于不同类别间在得分矩阵作的图中距离差别不明显和不同类别间有重迭部分，所以它是一种完全区分不同类别的工具【‘０４１。这种方法可以把新的观测值指派于有可能的类别中。７本研究的目的意义我国药材种类繁多，资源丰富，黄芪经过长期的人工栽培、杂交选育和自然选择己形成大量品种，然而来源复杂，品种混淆严重。仅《中华人民共和国药典》２０００年版收载的５３４种中药材，即有１４３种为多基源（二基源以上），占收载总数的２７％，其中二基源的有９２种，三基源的３８种，四基源的有８种，五基源的有４种，六基源的有１种。从以上收载的基源背景可见中药材品种的复杂性，而实际上中药材的品种还要比《中国药典》所揭示的复杂的多。这些情况都向我们提出了中药材品种鉴定的重要性和艰巨性。中药材基源品种的真伪，关系到该味中药的确切疗效和疗效的重现性，进而直接影响到中药制剂的质量，是实现中药现代化的首要问题。谢宗万研究员在论述中药品种鉴定的重要性时精辟地指出：“品种一错，全盘皆否”。在长期的医疗实践中，发现即使是同种药材，由于产地不同、野生与栽培以及生长年限不同都表现出质量和疗效上的差异；另一方面，随着育种亲本的集中化，育种中使用的材料越来越集中在一些优良品种或品系，使得所选育的新品种在更多的性状上更加相似而难以区分。这些问题为中药材鉴别方法提出了新的挑战，研究种质资源的传统方法主要是通过分析比较作物形态标记或细胞标记进行种质鉴定、分类和遗传学基础的研究，其缺点是可获得的标记数量有限‘３５１，已无法满足鉴别的需要。随着各种先进仪器以及分子生物学的发展，各种新的鉴别方法亦纷纷推出，如红外光谱鉴别，化学指纹图谱鉴别以及ＤＮＡ分子标记鉴别等，中药材鉴别领域显示出了蓬勃的生机。中药材分子标记鉴别多局限于ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ等早期的分子标记方法及少数几个基因序１４列的研究，且多用于遗传多样性研究以及正品与伪品等种以上分类单元的鉴定。同时，由于ＤＮＡ分子标记不受生物体发育阶段的影响，无法鉴别不同生长年限的药材，对同基源（基福建农林大学硕士学位论文因型）的野生与栽培药材的鉴别也存在一定困难，因此，单一ＤＮＡ分子标记鉴别无法解决中药材鉴别的所有难题。而目前飞速发展的代谢组学研究为中药材代谢标识物鉴别提供了可能，高通量、高灵敏度的ＧＣ．ＴｏｆＭＳ和Ｑ．ＴｏｆＭＳ等仪器能同时观察上千化合物，监测接近全景代谢物的变化，该方法不仅能观测到主要活性化合物还能检测到代谢中间产物（包括非活性物质）的变化，不仅能反映植物基因型的差异，也能反映环境因素的作用。由此可见，整合ＤＮＡ分子标记与代谢标识物的“双标记”方法是目前分子生物学与代谢组学发展的必然趋势，有利于建立与药材质量紧密连锁的特异、高效的标记平台，为中药材鉴别和质量控制提供新的方法和技术。本研究以对不同来源黄芪进行鉴别为主要目标，力求应用ＤＮＡ分子标记及代谢标识物鉴别相结合的鉴别技术解决中药材黄芪多基源品种、野生与栽培药材、不同产地药材的鉴别难题。该技术为有机融合现代分子标记技术及代谢组学最新研究技术，将为中药材鉴别提供新的思路。１５福建农林大学硕上学位论文第二章不同来源黄芪的ＡＦＬＰ分析研究ｌ材料方法１．１供试材料供试材料（表１）由中国中医科学院中药研究所提供表１不同来源的黄芪Ｔａｂ．ＩＡｓｔｒａｇａｌｕｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔ以上不同来源的材料均有六株不同的重复，且均为已干燥根的粉粹样品。１．２试剂及设备１．２．１引物和接头接头（ａｄ印ｔｏｒ）和引物（Ｐｒｉｍ砷的合成是ＡＦＬＰ技术中重要的步骤，而引物和接头的改进又是ＡＦＬＰ较ＲＡＰＤ，ＰＣＲ最主要的变革。１．２．１．１接头的设计与合成接头由核心序列和限制性内切酶特异性识别位点序列组成Ｃ１０５３本实验使用的限制性内切酶有ＥｃｏＲｌ和ＭｓｅＩ两种，故限制性内切酶特异性识别位点序列由其决定。ＥｃｏＲｌ接头的结构是：ＥｃｏＲＩ．ａｄＦ：５’一ＣＴＣｇＴＡｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣ一３ＥｃｏＲＩ－ａｄＲ：５’一ＡＡＴＴｇｇＴＡＣｇＣＡｇＴＣ一３ＭｓｅＩ接头的结构是：ＭｓｅＩＡ．５７——ｇＡＣｇＡＴｇＡｇＴＣＣＴｇＡｇ——３’ＭｓｅＩＢ：５’一ＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＩ一３１．２．１．２引物的设计与合成引物是通过ＤＮＡ自动合成仪人（上海生工）工合成的，ＡＦＬＰ引物的设计参照ｚａｂｅａｕ和１６福建农林大学硕士学位论文ＶＯＳｎ吲的方法完成的，主要由接头的设计决定，ＡＦＬＰ引物的一个重要的特征是所有引物起始于５７残基，而５／残基是与接头序列相对应的。ＡＦＬＰ的引物主要由３部分组成：核心序列（ＣＯＩ也）、限制性内切酶特异性识别位点序列（ＥＮＺ）和选择性延伸序列（ＥＸＴ）［１０７］。本研究共设计了１８条引物，其中带有一个选择性碱基的引物（预扩增引物）有４条，用于预扩增反应；带３个选择性碱基的引物有１６条，用于选择性扩增反应，本实验所用引物如表２所示：表２Ｔａｂ．２ＡＦＬＰ引物及其碱基序列ｂａｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅＡＦＬＰＰｒｉｍｅｒｓａｎｄｉｔｓ１．２．２试剂本试验所用的主要试剂ｎ０８‘１０９１有ＣＴＡＢ、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶及其缓冲１０ｘＰＣＲＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、限制性内切酶ＥｃｏＲｌ和ＭｓｅＩ及其缓冲液、Ｔ４－ＤＮＡ连接酶及其缓冲液、Ｄ２０００Ｍａｋｅｒ和１００ｂｐｌａｄｄｅｒ、琼脂糖、尿素、亲水硅烷、剥离硅烷、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、１３一琉基乙醇、冰醋酸、ＰＶＰ４０、９５％乙醇、甲醛、氯仿、水饱和酚、异戊醇、异丙醇、ＴＡＥ、ＴＢＥ、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、过硫酸铵、硼酸、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺。１．２．３仪器设备本试验所用的主要仪器冷冻离心机（ＳＯＰＶＡＬＬｆｒｅｓｃｏ）、恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）、琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂ＤＹＹ－６Ｃ）、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂ＤＹＹ－１０Ｃ）、聚丙烯酰胺凝胶电泳槽（北京君意电泳设备公司）凝胶电泳图像分析系统（美国Ｂｉｏ－ｒａｄ公司）、１７福建农林大学硕士学位论文紫外与可见光分析系统、微量移液器（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）、ＰＣＲ扩增仪（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，美国Ｂｉｏ－ｒａｄ公司）、超低温冰箱（－－菱）、冰箱（青岛海尔）、制冰机、漩涡混合器等。１．３实验方法１．３．１黄芪基因组ＤＮＡ的提取１．３．１．１基因组ＤＮＡ提取药品母液的配制ＤＮＡ提取药品母液的配制［１１０－１１３］（１）ｌｍｏＦＬ＂Ｉｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ８．０）：称取１２１．１９９Ｔｉｒｓ置于ＩＬ烧杯中，加入约８００ｍｌ去离子水，充分搅拌溶解。用浓ＨＣＩ将ｐＨ调至８．０，调整ｐＨ值时，将溶液冷却至室温，用去离子水将体积定容到ＩＬ。高温高压灭菌，室温储存备用。（２）Ｏ．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ＰＨ８．Ｏ）：称取ＥＤＴＡ１４６．１３９置于ＩＬ烧杯中，加入约８００ｒａｌ去离子水，充分搅拌溶解。用ＮａＯＨ将ｐＨ值调至８．０，用去离子水将体积定容到ＩＬ。高温高压灭菌，室温储存备用。（３）ＣＴＡＢ提取液：称取４０．９０８９ＮａＣＩ和１０９ＣＴＡＢ詈于５００ｍ１烧杯中，加Ａ．５０ｍｌＴｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ８．Ｏ）和２０ｍｌ０．５ｍｏｌ／Ｌｌｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．Ｏ），再加入３００ｍｌ去离子水，充分搅拌溶解，用去离子水定容至５００ｍｌ。室温储存备用。（４）ＴＥ（ｐＨ８．Ｏ）：量取１０ｍｌｌｍｏｌ／Ｌｔｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ８．Ｏ）和２ｍｌＯ．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）于ＩＬ烧杯中，加入８００ｍｌ去离子水，充分搅拌溶解，用去离子水定容至ＩＬ。室温储存备用。１．３．１．２黄芪基因组ＤＮＡ提取操作步骤黄芪基因ｌ：［ＩＤＮＡ提取［１１４－１１７１０１、取Ｏ．１克粉粹的黄芪粉末，加３—４次液氮反复快速研磨至细粉末状。２、将研磨后粉末转入２ｍｌ离心管。加入Ｉｍｌ在６５＂Ｃ预热的ＣＴＡＢ提取Ｂｕｆｆｅｒ。３、盖紧离心管盖，颠倒混匀，放至６５＂Ｃ水浴约１小时，期间颠倒混匀几次。４、１２０００转／分钟离心１５分钟。５、将上清转移至新离心管中并加入等体积的水饱和酚：氯仿：：异戊醇＝２５：２４：１，颠倒混匀５．１０分钟。６、４＂Ｃ，１２０００转／分钟离心１５分钟。７、将上清转移至新离心管中并／Ｊ口Ａ．等体积的氯仿：异戊醇＝２４：ｌ，颠倒混匀５．１０分钟。８、４＂Ｃ下１２０００转／分钟离心１５分钟。９、重复步骤７、８一次。ｌＯ、取上清加入２／３倍体积在．２０℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于．２０℃约３０分钟。１８福建农林大学硕士学位论文ｌｌ、４１２，１２０００转／分钟离心１分钟。１２、弃去上清后沉淀用７０％乙醇洗涤两次，室温下将沉淀挥干后用适量的含有ＲＮＡ酶的ＴＥ溶，３７。Ｃ温育ｌ小时。１３、用０．８％琼脂糖凝胶电泳检查。１４、测定浓度。１５、保存备用。１．３．１．３黄芪基因组ＤＮＡ浓度测定和品质检测用琼脂糖凝胶电泳对各样品的基因组ＤＮＡ进行质量检测和浓度测定。操作如下：各取ｌ１．ｔｌＤＮＡ提取液于０．８％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，用ＥＢ染色，在ＵＶ下观测并记录各样品ＤＮＡ的分子量大小和浓度，并观察ＤＮＡ是否发生降解。根据核酸蛋白仪检测ＤＮＡ样品。根据Ａ２６０／Ａ２８０，值确定ＤＮＡ样品的纯度：Ａ２６０／Ａ２８０＝１．８ＤＮＡ样品纯度较高：Ａ２６０／Ａ２８０＜１．８ＤＮＡ样品含蛋白质、多糖等杂质；Ａ２００／Ａ２８０＞１．８ＤＮＡ洋品含ＲＮＡ等杂质。检测结果为Ａ２６０／Ａ２８０在１．８左右，说明所提取的ＤＮＡ纯度较高，能满足ＡＦＬＰ分析的要求。放置于４。Ｃ冰箱保存备用。１．３．２ＤＮＡ的双酶切双酶切反应体系１０ｘＭｓｅＩＢｕｆｆｅｒＥｃｏＲＩ４ｐ．１Ｏ．３¨１０．５ｐｌ５００ｎｇ０．４ｐ，１ｕｐｔｏ４０ｐｌ１５Ｕ／ｌａｌ１０Ｕ／ｌａｌＭｓｅｌ基因组ＤＮＡＯ．１％ＢＳＡＨ２０３７℃酶切３小时，用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检查，在Ｕｖ下观测并记录。以上操作均在冰上操作，轻轻震荡混匀，低速短暂离心酶切完全后６５℃灭活１５分钟１．３．３ＤＮＡ的连接１．３．３．１接头的制备将合成的单链接头ＭｓｅＩ－ａｄＦ、ＭｓｅＩ．ａｄＲ用灭菌的超纯水分别稀释成１００ｐｍｏｌ／Ｉ．ｔｌ后等体积混合，９５。Ｃ变性５分钟，室温复性，ＭｓｅＩ接头终浓度为５０ｐｍｏｌ／ｌａｌ：将合成的单链接头ＥｃｏＲｌ－ａｄＦ、ＥｃｏＲｉ．ａｄＲ用灭菌超纯水分别稀释成１０ｐｍｏｌ／ｇｌ后等体积混合，９５０Ｃ变性５分钟，１９福建农林大学硕士学位论文室温复性，ＥｃｏＲＩ接头终浓度为５ｐｍｏｌ／ｌｘｌ，４。Ｃ冰箱存放。１３３．２连接反应向１３．２所述的４０Ｉ．ｔｌ酶切反应体系中加入１０ｌｘｌ下述反应混合液艮ＤＲＪ接头（５ｐｍｏｌ／９１）ＭｓｅＩ接头（５０ｐｍｏｌ４ｔ１）ｌＯ×Ｔ４．ＤＮＡ连接酶ＢｕｆｆｅｒＴ４－ＤＮＡ连接酶４℃过夜（约１２小时）。２¨ｌ２“ｌ５１ｘｌｌｐｌ用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检查，在ｕＶ下观测并记录。以上操作均在冰上操作，轻轻震荡混匀，低速短暂离心连接结束后６５＂Ｃ灭活１５分钟１．３．４预扩增建立如下预扩增反应体系１０ｘＰＣＲＢｕｆｆｅｒｄＮＴＰ２１ｘｌ１．６１ｓｌＯ．６ｐｌ０．６ｐｌＯ．２１ｘｌ２“ｌ１３Ｊ．ｔｌ２．５ｍＭ５０ｎｇ／Ｊ－ｔｌ５０ｎｇ／ｌａｌＭＯ１ＥＯ１Ｔａｑ酶酶切连接产物Ｈ２０以上操作均在冰上操作，轻轻震荡混匀，低速短暂离心建立如下连接预扩增ＰＣＲ程序９４℃９４℃５６℃２ｍｉｎ３０ｓ３０ｓ７２℃ｌｍｉｎＧｏｔｏ２，２９ｔｉｍｅｓ７２℃５ｍｉｎ取５１ａｌＤＮＡ预扩增产物用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检查，紫外检测预扩增的效果。预扩增产物用灭菌的超纯水稀释２０倍，于．２０℃冰箱保存备用。２０福建农林人学硕士学位论文６９４５圣３。０ｓ二｝一１℃＞１℃２７）ｅｌｃｙｌｍｉｎＣ／Ｃ。７．Ｊｏ－（ｅｌｃｙＣ福建农林大学硕士学位论文５５。Ｃ温浴），倒入ｌＬ的容量瓶中，加入１２５ｍｌ４０％丙烯酰胺，用蒸馏水定容至ｌＬ，上下颠倒混匀，用滤纸过滤至１Ｌ的玻璃瓶中，４＂Ｃ储存备用。（５）剥离硅烷：４７．５ｍｌ氯仿中加入２．５ｍｌ二甲基二氯硅烷，充分混匀，４。Ｃ储存备用。（６）亲和硅烷：２ｍｌ９５％乙醇中加入１０ｐｌ冰醋酸和１０ｐｌ存），此混合试剂要临用现配。１．３．６．２玻璃板的准备玻璃板清洗玻璃板用１０％ＮａＯＨ溶液浸泡过夜，用清水反复冲洗至完全干净后蒸馏水冲洗一遍晾ＰｌｕｓＯｎｅＢｉｎｄ—Ｓｉｌａｎｅ（４℃储干。用装有无水乙醇的喷壶喷洗两块玻璃板，用无屑纸巾沿一个方向均匀涂抹玻璃板２次，至完全去杂质无污迹，自然晾干５ｍｉｎ后备用。涂板将配制好的亲和硅烷２ｍｌ倒在平玻璃板上，用无屑纸巾沿一个方向均匀涂抹玻璃板２～３次，室温放置晾干，５ｍｉｎ后再用装有无水乙醇的喷壶喷洗玻璃板，用无屑纸巾沿一个方向均匀涂抹玻璃板２次，室温放置晾干５ｍｉｎ后备用。将配制好的剥离硅烷２．５ｍｌ倒在凹玻璃板上，用无屑纸巾沿一个方向均匀涂抹玻璃板２—３次，室温放置晾干５ｍｉｎ后备用。装板两块玻璃板晾干后，将两块玻璃板涂有硅烷的两面相对放置，将两条垫片（ｓｐａｃ盯）擦拭干净后整齐笔直地夹在两玻璃板之间，对齐后用夹子固定紧，将夹好垫片固定好的的两玻璃板，放置水品桌面上准备灌胶。１．３．６．３凝胶的制备将配制好的７０ｍｌ５％聚丙烯酰胺凝胶倒入制胶器中加入６５ｐｌＴＥＭＥＤ和２７０ｐｌ１０％ＡＰｓ，迅速混匀后静置一会后开始灌胶，控制好速度，将胶匀速推入两玻璃板之间。将干净的梳子倒插入合适的位置和深度。水平放置２小时以上，使之聚合凝固后以备电泳（若晚上灌胶，可过夜待次日清晨使用）。１．３．７电泳（１）预电泳待凝胶聚合凝固后，小心将梳子拔出。用蒸馏水冲洗点样槽附近，冲去点样槽外部碎胶。卸下装板槽，将玻璃胶板安置于电泳槽中预电泳。电泳槽内加入适量的ｌｘＴＢＥ，玻璃板电泳槽内也加入适量的ＴＢＥ。安装好后开始预电泳，２２福建农林大学硕士学位论文设置固定电泳功率８５Ｗ，预电泳３０ｍｉｎ一４０ｍｉｎ，使温度上升到至少５０。Ｃ。（２）样品准备每个ＰＣＲ管中（己有２０Ｉ－ｔｌ选择性扩增产物）加入８１ａｌＬｏｄｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，冰上操作。在ＰＣＲ仪中９５＂Ｃ变性５．１０分钟，迅速取出置于冰上，５分钟之后即可点样。按照顺序点样，将Ｍａｒｋｅｒ和样品依次点入。（３）点样预电泳结束后，按下暂停键，用注射器把尿素和气泡感出并用去除碎胶以防止其干扰点样，在胶的中间和两边各滴一滴ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ指示胶平面后小心将梳子顺向插入点样槽合适的深度。迅速上样，每孔８ｐｌ。（４）电泳点样完毕后开始电泳，设置同定电泳功率８５Ｗ，电泳至ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ第二条蓝色指示线电泳至离电泳槽出１５ｃｍ时停止电泳，大约２小时ｌＯ分钟。１．３．８银染１．３．８．１银染试剂（１）１０ｍｇ／ｍｌ硫代硫酸钠：取２９硫代硫酸钠溶解于２００ｍｌｄｄＨ２０中，充分混匀，室温保存备用。（２）固定液（１０％Ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ冰醋酸１：１５０ｍｌＡｃｅｔｉｃａｃｉｄ中加入１３５０ｍｌｄｄＨ２０，混匀，用时现配。（３）染色液：：使用前５分钟向染色盘中加入１．５ＬｄｄＨ２０和１．５９ＡｇＮ０３，使其完全溶解，使用前再加入２．２５ｍｌ甲醛混匀。（４）显影液：将４５９无水ＮａＣ０３加至１．５ＬｄｄＨ２０中，放在磁力搅拌器上搅拌，使其完全溶解，放置于４＂Ｃ冰箱使其冷却至４＂Ｃ。临用前倒入显影盘中并加入２．２５ｍｌ甲醛和３００Ｉ．ｔｌ１０ｍｇ／ｍｌ硫代硫酸钠。１．３．８．２银染仪器磁力搅拌器，漩涡混合器，摇床，塑料盘４个。１．３．８．３银染程序（１）固定电泳结束后，关闭电泳仪，卸下玻璃胶板，小心分开两块玻璃板。将带有凝胶的一块平玻璃板放入装有１．５Ｌ固定液的同定塑料盘中，确保有凝胶的一面朝上，放至水平摇床上摇动至少２０分钟，直至蓝色指示线褪去颜色。２３福建农林大学硕士学位论文（２）水洗固定结束后，小心取出玻璃板，放在装有１．５Ｌ蒸馏水的水洗塑料盘中漂洗，在水平摇床上摇动５ｒａｉｎ。水洗两次，第二次水洗液保留备用。（３）染色水洗结束后，小心取出玻璃板，放入装有１．５Ｌ染色液的染色塑料盘中，在水平摇床上摇动至少３０ｒａｉｎ。（４）显影染色结束后，将玻璃板放在装有１．５Ｌ蒸馏水的水洗塑料盘中迅速漂洗一次，注意玻璃板在蒸馏水中停留的时间不应超过１０秒钟。水洗结束后立即转入装有１．５Ｌ预冷至４。Ｃ显影液的显影塑料盘中，在水平摇床上摇动，直至条带清晰为止。（５）终止当条带清晰可见后，取出显影过的玻璃板放入固定塑料盘中先前使用过的固定液中，终止至少５ｒａｉｎ。（６）漂洗直接取出终止后的玻璃板，放在水洗塑料盘中使用过的水洗液中水洗后用自来水冲洗两面数，室温放置，晾干，统计并照相。注意：胶面未晾干时，要小心放置及观察，避免胶面被划破碎。１．４数据分析１．４．１数据统计通常情况下，ＡＦＬＰ每一条扩增带都对应着一个基因ＤＮＡ分子位点，出现多态性扩增带，说明某个或某些品种在该位点上存在变异。因此，参照常青和周开亚等…８，１１９１数据分析方法，将ＡＦＬＰ标记作为等位基因进行多态性研究，每一条扩增带视为一个性状，有此谱带的作为１个分子标记，赋值为“１”，无此带时赋值为“０”。以此为数据处理的标准。根据扩增电泳条带的有无构建Ｏ．１矩阵。由于黄芪ＡＦＬＰ扩增条带的分子量多集中１００ｂｐ．５００ｂｐ之间，所以对分子量大于５００ｂｐ，小于１００ｂｐ的条带不予记录。同时只对１００ｂｐ．５００ｂｐ之间条带清晰易辨、在重复实验中稳定出现的条带进行记录。将所有清晰的ＡＦＬＰ多态性ＤＮＡ扩增条带数据输入到数据矩阵。１．４．２聚类分析‘１２０ｌ２４橱建农林大学顾士学位沧文用生物学统计分析软件利用ＭＥＧＡ４软件对供试黄茛样品的遗传距离进行聚类分析，构建了黄苠的遗传距离聚类图·用ＵＰＧＭＡ（ｔｍｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉ螂咖ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍ髓ｎｔ算术平均非加权配组法）生成树状聚类图。２结果与分析２．１基因组ＤＮＡ的制鲁基因组ＤＮＡ的成功制备是ＡＦＬＰ成功的芙键．因为ＤＮＡ的质量会直接影响酶切和连接的效果。中药黄芪舍有较多的酚类物质、蛋白质和多糖，这些物质严重影响了ＤＮＡ的提取质量．酚类化合物氧化后易与ＤＮＡ麸价结合而使ＤＮＡ里揭色．并抑制酶切反应。多糖的存在会使ＤＮＡ沉淀里凝胶状态，既难干燥又难溶解，而且严重影响酶切。在提取液中加入了ｐ一疏基乙醇，Ｂ一琉基乙醇可以防止酚类物质的氧化，ＰＶＰ４０作为鳌台剂能够结合多酚类化台物，在离心过程中可被直接除去。在提墩过程中上清液中的ＤＮＡ用氯仿屏戊醇反复抽提去除蛋白。２．１．１琼脂糖凝胶电泳检测从图ｌ可以看出．提取的黄芪基因蛆ＤＮＡ．在泳道中呈现均匀的弥散状（Ｓｍｅａｒ），经ＲＮＡ酶处理后，此现象仍然存在．说明并非是小片断的ＲＮＡ。造成此现象的原因可能有：黄芪采集后经过了室温干燥、耪粹等处理过程，并且长期保存在宣温等因素使ＤＮＡ自然降解，但这样的降解经过实验发现对ＡＦＬＰ分析影响不大（见以后报导）。圈１黄蓖基目组ＤＮＡ电竦姑采２，１．２用校酸蛋白分析仪检翱从检Ⅻ４结果（表３）看出．Ａ２６０ｎｍ／Ａ２￥０ｎｍ在１．８左右．说明所提取的ＤＮＡ纯度较高能满足ＡＦＬＰ分析的要求。放置于４＂Ｃ冰箱保存备用福建农＃大学硕士学位论文表３部分黄蓖基目组ＤＮＡ捡蔫结果Ｔａｂ３Ｔ喊～恼ｏｆ邮Ａ∞１驴Ｉｍ鲫啦ｎｅＤＮＡ浓度ｎｇｕｌ４５５６２２２９７２４４３．３４样品Ｓａｍｐｌｅ１２～１９—２Ｄ２ＭＤ２ｓｏ１８９１．７９ｌ９４ｌ８８１．９１８６１７８ｌ７８１．８２１９１１．８３ｌＯ－．３ｌｏ＿一１３１６９７１９４．９５９—６１０－·２３９１１２４３．０３２８５３８２３０．９２１９６．２８１８４３４１０－－４９．－４１０—５１０～６１７～ｌ１．－４１７－．３３５７．９３２１１．９４３０４．５７２７８．１１１．８８１８５ｌ８７１８９６－－ｌ１１～６２．２ＤＮＡ酶切圈２酶切屯诛结果Ｆｉｇ２田３连接电泳结果ＦｉｇＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏ臌ｉｓｏｆｄｉｇ∞ｔｉｏｎ３ＥＩ％呐口｝Ｉｏ嘲ｉｓｏｆ００ｎｎｅｃｌｌｏｎ酶切产物用１２％的琼脂糖凝胶电泳，从图（２）中可以看出ＤＮＡ在泳道中呈现均匀的弥敝状（Ｓｍｅａｒ），并且最上方的士带也已消失．表明提取的基因组ＤＮＡ能够积酶切并且酶切比较彻底，同时还表明ＤＮＡ纯度高．没有抑制酶切的杂质。２．３ＤＮＡ连接橱硅农林大学填±学位论文用Ｉ２％琼脂糖凝胶电泳检查连接产物从圈３可以看出ＤＮＡ在泳道中均匀的弥散（Ｓｍｅａｒ）带的亮度比酶切电泳结果提高了可以推断，接头连接效果理想。２．４预扩增用ｌ２％琼脂糖凝胶电泳检查预扩增产物（图４所示）．从图中能够看出预扩∞增引物对Ｍ０１．Ｅ０１的效果要好于引物对∞∞Ｍ０２－Ｅ０１．扩增的两个样品比较均一，故∞选用Ｍ０２．ＥＯＩ作为选择性扩增引物对。∞象带主要集中在ｌＯｏｈＤ．７５０ｂｐ之间。∞圈４预扩增电泳Ｆｉｇ４ＥｌｅｃＢｏｐｈ—ｉｓｏｆｐｒ—ｐｌｉｆｉｃａｌｉｏｎ２，５选择性扩增引物筛选用上海生＿亡公司台成的分别有３个选择性碱基的７个ＥｃｏＲｌ引物和４个Ｍｓｄ引物ｆ表２）组成的２８对引物组合进行初步筛选，对样品的模板ＤＮＡ进行选择性扩增，聚丙烯酞胺凝胶电泳观铷Ｉ结果。不同的引物组合扩增的效率不同，在同一品种产生的带型和条带毅目存在很大差异。本试验筛选主带比较多，主带差异多且明显的ＩＩ对引物组台用于ＡＦＬＰ选择性扩增。通过筛选，挑选出如下组台（表４）进行选择性扩增表４选择性扩增的引物对Ｔａｂ４ＳｅＬｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉ∞ｔｉｏｎｐｎｍ懿Ｍｓｅｌ端引物碱基序列（５７－３’）ＥｃｏＲＩ端引物碱基序列（５’３ｇＡＴｇＡｇＴＣＣＴｇＡｇＴＡＡＡＡＣＥ３７ｇＡｃＴｇｃｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣｇｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＹｒＣＡｇｇｇＡＴｇＡｇＴＣＣＴｇＡｇＴＡＡＡＡｇｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣｇｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＴｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡｇＡｇＡＣＴｇｃｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡｇｇＭ３８ｇＡＴｇＡｇＴＣＣＴｇＡｇＴＡＡＡＣＴｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡｇｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＭ４０ｇＡＴｇＡｇＴＣＣＴｇＡｇＴＡＡＡｇＣ洲阱肼脚叫肼邸阱肼ｉ；ｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣｇｇＡＣＴｇＣｇＴＡＣＣＡＡ＇ＶｆＣＡＣＴ福建农林大学硬±学位论文Ｆｉｇ５Ｔ｝ｍｄｃｄＴ鼬…～ＩｂｏｆｓｅＩ∞“＂ａｍｐｌｉｆｌ∞ｔｉｏｎ田５％分选择性扩增的电冰结果２．６簸据分析２．６．Ｉ数据统计Ｆ图（圈６）是引物组合Ｍ３２－Ｅ３７的扩增结果，挑选条带清晰，筹异明显的统计，共统计７个多态性位点数。所有ｔ１对引物对攻扩增出８５个多态性位点数，统计结果见表５。福建农林＾学硕士学位论空图６引物Ｍ北－Ｅ３７的扩增Ｆ嘻６＾ｍｐｌｍ酬ｉ蚰ｏｆＭ３２－Ｅ３７脚目寰５１１对引物组台的扩增结果Ｔａｂ５Ｔｌｌｅ瞄ｕ］ｔｓｏｆｌｌ加溉ｏｆｐｒｉｍ螂ａｍｐｌｉｆｉｅｄ２．６．２聚共分析用生物学统计分析软件利用ＭＥＧＡ４软件对供试黄芪样品的聚类分析．构建丁黄芪的遗传距离聚类翻．用ＵＰＧＭＡ（ｅｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐ“ｒ－ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅ蛐，算术平均非加权配组法）生成树状聚类圈（图７）。福建农林大学硕士学位论文２：图７供试贡芪样品的ＵＰＧＭＡ聚类分析Ｆｉｇ．７ＵＰＧＭＡｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓａｍｐｌｅｓ从ＵＰＧＭＡ聚类分析结果看，黄芪品种问差异显著，大体分为三组，在第一组（主要是１２、１４、１５、１６、１７、１９）蒙古黄芪中只有甘肃宕县的两个膜荚黄芪混杂在其中，在这一类中，各个地域差异不太明显，并且野生黄芪（１９．山西应县）与膜荚黄芪混杂：第二组类（１、２、６、９、１１、１８）中各个地域差异非常明显，同一产地的同一品种多数比较集中，除多数是膜荚黄芪外还有甘肃漳县的野生蒙古黄芪（１８），这一组的野生黄芪（９、１１、１８）与栽培黄芪（１、２、６）差异非常显著；第三组（３、４、５、６、７、８、１０、１３）除１３．吉林汪清蒙古黄芪外都是膜荚黄芪，且地域差异常明显，且东北地区的相对集中（７、８和１０、１３）山东、河北的比较相近，ｌＯ．黑龙江鹤岗野生黄芪与吉林汪清蒙古黄芪比较相近外，与其它地区的相隔比较远。从整体上看，两个品种间存在着明显差异。３０福建农林大学硕上学位论文第三章不同来源黄芪的代谢物谱研究１供试材料基盐酸盐、十九烷酸、核糖醇、氦气、Ｍｉｌｌ．Ｑ净水系统制备的超纯水。上液氮中研磨十九烷酸ｌ．咖、◆去蕃磊二：孟：二并叫。上上上上心＝嚣徘上层水相极性部分３Ｉ下层脂相非极性部分福建农林大学硕士学位论文３．２样品前处理样品干燥：用冷冻干燥机将水相冻干，将氯仿相用氮吹仪吹干。样品衍生化：向干燥的脂相样品中加入４０ｐ．１２０ｍｇ／ｍｌ的甲氧氨基盐酸盐，密封，在３７＂Ｃ温浴，反应２小时。加入７０ｐｌＭＳＴＦＡ，密封，在３７。Ｃ温浴，反应３０ｒａｉｎ。３．３ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ检测实验条件：表６ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ参数设置Ｔａｂ．６ＰａｒａｍｅｔｅｒｓｅｔｔｉｎｇｏｆＧＣ·ＴＯＦ／ＭＳＧＣＧＣｃｏｌｕｍｎＣａｒｒｉｅｒｇａｓＦｒｏｎｔｉｎｌｅｔＴｙｐｅｒＳｐｌｉｔＲａｔｉｏＴａｒｇｅｔｆｌｏｗＦｒｏｎｔｉｎｌｅｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＤｕｒａｔｉｏｎ安捷伦气相系统６８９０ＤＢ５一ＭＳＨｅｌｉｕｍＳｐｌｉｔ１／１０（脂相）、１／２０（水相）１．５ｍｌ／ｍｉｎ２９０℃ＥｎｔｉｒｅＲｕｎ脂相：８０℃４ｍｉｎ；５。Ｃ／ｍｉｎ３３０℃５ｍｉｎＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｒｏｇｒａｍ水相：８０℃４ｍｉｎ；５。Ｃ／ｍｉｎ１８０℃２ｍｉｎ；５。Ｃ／ｍｉｎ２２０℃０ｍｉｎ；１５℃／ｍｉｎ３３０℃５ｍｉｎ２８０℃１０ＬｅｃｏＴｒａｎｓｆｅｒｌｉｎｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＤａｔｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＲａｔｅＭＳＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｄｅｌａｙＳｔａｒｔｍａｓｓ５ｍｉｎ８０５００２０１７００７０ｅｖＥｎｄｍａｓｓＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｒａｔｅ（ｓｐｅｃｔｒａ／ｓｅｃｏｎｄ）ＤｅｔｅｃｔｏｒＶｏｌｔａｇｅＥｌｅｃｔｒｏｎＥｎｅｒｇｙＩｏｎＳｏｕｒｃｅ２００℃３．４数据处理ＣｈｒｏｍａＴＯＦ用来数据预处理：峰平滑去噪，３ｓ峰宽，基线校正，信噪比１０：ｌ，预处理结果导出成ＮＥＴＣＤＦ檑。ＸＣＭＳ（Ｒｐｌａｔｆｏｒｍ）用来进行保留时间校正，峰识别，峰提取，计算峰面积，内标扣除。ＳＩＭＣＡ—Ｐ对数据进行规一化、中心化后进行主成分分析（ＰＣＡ），偏最小二乘法一判别分析（ＰＬＳ．ＤＡ），正交偏最，ｊ，－－乘一判别分析法（ＯＰＬＳ）３２幅建表韩大学硕ｆ学位论文４结果与分析４．１不同来漂黄苠的脂相化台物代谢谱圈通过ＣＪＣ－ＴＯＦｆＭＳ分析ｔ得ｉ悟个不同来潭黄芪的化合物代谢谱图。如图（图７）所示部分谱图，从代谢谱图中看出，同一品种不同产地及不同品种间都有较大差异。内蒙古固阳蒙古黄芪（家种）姐虬』Ｊｌｌｌ』。ｕ岫虬』地山妣Ｌ』＆山西应县藏古黄芪（野生）ｉｍｍ黑龙江鹤岗膜英黄芪（家种）㈨㈨＝＝㈨圉ｓ部分黄蓖代谢谱（脂相）Ｆｉｇ甘肃渭源膜美黄芪（野生）此～ｌ“龇山舭ｈ出在ｉｉ蛳山８ＭｅｔａｂｏｌｉｅｓｐｅｃＩ～ｍｏｆ—ｇａｌｕｓ（ＬＪｐｉｄｐｈ∞ｅ）４．２黄芪脂相部分代谢物￥ＩＭＣＡ－Ｐ分析对不同来源黄茛脂相部分资料ＳＩＭＣＡ－Ｐ分析（图９所示），在ＰＣＡ（ａ图）模型中，两种黄芪（蒙古和膜荚黄芪）多数能够分得开．有分离的趋势，但是还有部分不能分开：ＰＬＳ模型（ｂ图）中，从ＰＬＳ分析结果看，除有少数不能分开外．基本能够区分蒙古黄芪和膜荚黄苠。据此，我们根据脂相的分析可以推断出，两种黄芪存在明显的物质成分差异．可以利用代谢物谱技术区分不同品种的黄茛。福建农＃大学碗士学位论文。；。。。。。。。。。。。躐骚ｋ．。－。、—、＼；：ｊ、‘乡ｊ．·０～＼＼＼ｊ■１日【目‘●…’ｚ………ｚ‘●，¨黄蓖脂相靠针代谢物ＰＬＳ巾Ａ分忻湘蹦岫”㈣””；：端‰。ｂ圈９赞蓖尉相代谢钎ＳＩＭＣＡ－Ｐ分析Ｆｉ９９ＡｍｍｇａｌｕｓｌｉｐｉｄＤ１１ａ”ｍｂｏｌｉｌａＯｆ￥ＩＭＣＡ－Ｐ帅ｓ１）ｓｉｓ结合ｌｏａｄｉｎｇｐｌｏｔ．Ｓ－Ｈｏｔ和ｖｌｐ－ｐｌｏｔ幽１０（ａ、ｂ、ｃ）．选取对造成上述差异的特异毗离子，并进一步搜出与其相对应的色谱峰，通过ＮＩＳＴ和ＧＯＬＭ数据库检索，鉴定相应的化台物．作为吒分絮古黄蓖和膜荚黄芪的代酣标示物．最终控出与之对应的化台物（表７）。福建农林大学颈士学位论空ＬⅧ。ｇＰＩ。ｔ磷愁㈣。ｉｉ”’麓参蝻：．：矗，≯溶？ｌ｝Ｆ。．｜尊竭嗣Ｉ［Ｉ…。一…二墨ｉｌｉｉｉ＋ｉｌｉｉｉｉｉ赫ｌ黼《豳‰山Ｉ一一ＴｌＬ圈１０脂相特征离于峰舟析Ｆｉ§ＩＯｎ…Ｉｙｎ§时ｄｗａｃ附｛ｓＩＩ∞ｉ嘶ｐｃａｂｏｆｌｉｐｉｄｐｈａｓｅ梧建农林大学硬十学位论文寰７黄蓖脂相可瞻的代澍标讽物１ｍ７Ｐ蜷ｉｂｌｅＭ曲岍Ｉｉ蜘ｍ妇ｏｆ＾Ｉ☆１叫∞ｌｉｐｉｄＰｈａ＃啷ｐ∞ｋｎｕｍｂｅｒ１３８５９９８０２８４．８１２４．１７６３９８７№ｎｎｍｅＨｅｘａｄｅｃａｎｏｉｅａｃｉｄ？７８５３１１７４４６３６１１１７１５４９１７２２１６３ｌ２１３８９９１７３５５６竹ｌ２８１５１４９４ｍｍｓ－９－０ｃｌａｄｅｃｅｎｏｉｃ孔ｉｄＳｆｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ７７４４５２０８２５０２２８３２０４１３ｌ９Ｉ２６４３２２３２９Ｉ３６３．９８３．５６４３．ｊ８３．０２５２¨３９９１７２８．６９９６３３６７１５１６１４３６（Ｚ，Ｚ）－９，１２－Ｏｃｌａｄｃｃａｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄ７７２３６２５８洼；。？嚏示持鉴定｝ⅢＰ地ｔ古＾＊膳＿Ｈ析趱潞。‰。。焉。｜．ｆ，，。＝、＼彦爹聂一、ｔ＼…。ｏ·…，＼＼—～ａ蹩夕／Ｈ“＂‘…‘＿ｔ¨”“Ⅲ‘。；……ｌ‘．．ｍ‘¨。，。。。…。＋。。。照撼‰…／，，ｉ～、！砰｝、、／一１０‘ｌ，…Ｉ……”ｊ氓／￡ｏ…ｔ、、＼／＼√≤多＼ｂ：一ｔＺ：。文…‘，／ｊ／·Ｉ“·…¨…·＂……ＦｉｇＩＩＰＬＳｕａｌｙｓｌｓｏｆｌｉｐｉｄｐｈａｓｅｏｆｄｉｆｆｅｒ“由』ｍｏｎｇｈｏｌｉⅢ（ａ）∞ｄ』＾ｌ口＇ｈ∞Ｗ“删匝１１不周Ｐ地（ａ）童古黄苠和（ｂ）臃蓑冀芪腊相ＰＩ．Ｓ分析福建农林大学硬士学位论文对同一品种不同产地蒙古黄芪进行ＰＬＳ分析（图Ｉｌ－ａ）。同一产地的相对比较集中．模型中山西和甘肃的位置比较接近．而野生黄芪和吉林的相对其他产地的距离远：膜荚黄芪的地域差异更加明显（图ｌｌ由），东北三省的聚集在一起．甘肃的比较集中．山东与河北的也相对集中，这与地理位置的远ｊ丘比较类似。嚣龙江野生黄芪与栽培黄芪差异也比较明显。。。。。；。。野，。。。。较ｉ芝！ｉ；总岫。。麓崭／—ｆ一／■ｊｏ≮二，乡ｔ．ａ∞｛ｏａ………ｌ‘’一…∞Ⅲ…，…＿＊ｉ■ｊ／■？ｂ弋。。二／／ｊｊｏ。‘。’’…’１‘。…。“…。“。‘１’…１”“’。；。．。…，。ｏｆｌｉｐｉｄ曲８∞田１２栽培与野生的（ａ）壁古黄蓖与（ｂ）膜荚黄芪脂相ＰＬＳ分析Ｆｉｇｒｌ２Ｃｕｌｉｌｖａｆｉ硼ａｎｄｗｉｌｄｅ［ｍｏｎｇｈｏｌｉ埘（砷Ⅻｄ』ｍ∞∞ｍ棚Ｄｎ口俐ＰＬＳ蛐ａｌｙｓｉｓ对薰古黄芪与膜荚黄芪的栽培与野生黄芪脂相进行ＰＬＳ分析（图１２）。模型中蒙古黄芪（图１２－ａ）与膜荚黄芪（图１２击）的栽培黄芪与野生黄芪差异都比较明显．其中从嘲中看出几乎所有的裴古黄芪的栽培与野生黄芪之问都有显著差异，图膜荚黄芪的栽培与野生黄芪中有极少数混杂。福建农林大学颤±学位论文４．３黄苠水相部分代谢钧ＳＩＭＣＡ－Ｐ分析。。。。，。。＋。。。巍嬲嚣。。ｂｄ２１０图１３水相代谢勃ＯＰＬＳ分析Ｆ骣１３０ＰＬｓ强ａ］ｙｓｉｓｏｈｍ目ｐＩｌ雠ｍｃｍｂｏｌｉｔｅ对不同来源黄芪水相部分资料ＳＭＣＡ－Ｐ分析（图１３所示），在ａ圈的ＯＰＬＳ模型中，两种黄芪（蒙古和膜荚黄芪）除有少数混杂外，大部分差别明显；ｂ图３Ｄ－ＰＬＯＴ模型中结果跟ａ图的ＯＰＬＳ分析结果相似。据此，我们根据水相的分析也可以推断．两种黄苠存在明显的物质成分差异，导致两个品种的代谢物数据分析结果明显地分成两组。结合ｌｏａｄｉｎｇｐｌｏｔ，Ｓ－ｐｌｏｔ图１４（ａ、ｂ），选取对造成上述差异的特异ｍ／ｚ离子．井进一步找出与其相对应的色谱峰．通过ＮＩＳＴ和ＧＯＬＭ数据库检索．鉴定相应的化合物，作为区分蒙古黄苠和膜荑黄芪的代谢标示物，最终拄出与之对应的化台物（表８）。梧建农林大学研±学位论文。岬山。搿嬲鳓一。。＾。。三？、－血。．—瞄２４＾二ｉ；ｔ一■荦∞《，２々ｓ．Ｄｌｏｔ揣销：船ｍ】ｂ””””“”’图１４水相特征离子分析Ｆｉｇ［４Ｔａｅ删ａｌｙｓｌｓｏｆｃｈ—ｔｅｄｓｔｌｃｓｉ叽Ｄ目ｂｏｆ帅ｔｅｒｐｈａｓｅ表ｓ黄苠水相可能的代谢标识物Ｔａｂ８Ｐｏ＃ｉｂｌｅＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｍａｒｋ＊ｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｗｍ日Ｄｈａ∞ＶＩＰ佻ａｌ（ｎｕｍｂｅｒｍ／ｚｒｔｎｆｌｎｌ＠８９３３８８２８１２８１３６７９７８．１５７３７１０１４７１５４３ｉｎｏｓｆｉｎｏｌ７０９９１０５８１４３７６４０６ＬＦｒｏｌｉｎｅ６１７１３３９１６０１６５２Ｄ－Ｇａｌａｃ｜ｏｓｅ５６２４８１２９９２１７１６１６２Ｄ—Ｆｒｕｃｔｏｓｅ４１７１５７２１１６１３２８６Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ４０ｌ１１４８”３１５３２９１．２．３一Ｐｒｏｐａｎｅｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ３７６２６１８２１８１０１４３Ｌ－Ｈｏｍｏｓｇｉｉｎｃ３６２１０６３１４７６１０９６Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｉｅａｃｉｄ３５６３３“１７４１１２９４Ｂｕｔａａｏｉｃ∽ｉｄ３１３２２８９１４７１０７４７Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｉｅａｃｉｄ注：“？”表示待龌定福建农林大学颤士学位论文ｔａ一＊ｔ＊一ｔｍ—ｎ嚣鐾虢＝麓嚣—一／—、／·。＼ｏ≮ｊ．月ａ｛＊乡－¨ａ蛐Ｉ…ｌｎｎ：《ｍ…‘～……ｍ，¨聪《黄蓖家种和鼾生术相“较油＿￡时’…－…Ⅲ搿豫鬻”一麓嚣／一—一—、＼／／．．Ｊ＼…∞１，¨口…∞ｍ∞目＾Ⅺｊｊ≮１０…＊∞＊＃∞ｗ＊∞…’…１ｗｊ乡Ｆ】ｂ…‘’…“ｍ’……“Ⅲ“…１¨’－‘。’”Ｆ崦１５“ｍ咖∞ｄｗｉｌｄＪ闰１５栽培与野生的（ａ）蒙古黄蓖与（ｂ）膜荚黄蓖水相ＰＬＳ分析ｍｏｎｌ由ｏｌｉｃｕｓ（ａ）肌ｄ』ｍ删ｈⅢ一斜ＰＬｓ柏ｄｌｙｓｉｓｏｆ帅时由％对同一品种的栽培与野生黄芪水相进行ＰＬ￥分析（图１５）。模型中（ａ）蒙古黄苠与（ｂ）膜荚黄芪的栽培黄芪与野生黄芪差异都比较明显，其中从圈中看出（ａ）蒙古黄芪栽培与野生黄芪之间都有明显差异，而（ｂ）膜荚黄芪的栽培与野生黄芪有少数比较接近。福建农林大学碗±学位论文不蚓产地蕞古黄蓖爿ｃ相比较。“…。州帅…。“／。ｊ。．ｒｊ／／（弋搿稔驴”（１·弋：…５ｉ‘广：、＼／／■、甘龠＼＼，瓣≥ｇ…“／／＼＼＼～—～：／’《＾目＃ｌ＊Ｒｓ删不同产地膛奠茸苠水相Ｅ软勰尝：掰：岫。。№…１Ⅺ１∞１１Ｑｂｊ≤。ＡＷ∞ｍ“／＠／…一一一＊／、、、、弋ｒ盗『、Ｐ…－ｔ＼｝ｑ＿…－＊一一乏＝６■＼＼＼、＜一，南秽”…Ⅷｍ冲二．＼、／／ｍ∞∞ｍ＊ｏ一１０∞∞∞∞∞ｗ∞∞…１Ｋｘ【２Ｉ。１ｗ·＇ｉｉｉ７、ｊ，。／１∞１∞“【１Ｊ’，”：‘”ｍ口一’ｍ“】“ｉ”‘。，自图１６不同产地（ａ）鏊古黄芪和（ｂ）膜荚黄芪水相ＰＬＳ丹析Ｆｉ９１６ＰＬＳ哪ｌｙ￥ｉｓｏｆｗａ暗曲ａ∞０ｆｄｉｆｆ－ｃｒｅｎｔｏｆｉｇｉｎ』ｍｏｎｇｈｏｉｉｃｗ（ａ）锄ｄ』眦ｍ６…ｄｓｍ对同一品种不同产地黄芪水相进行ＰＬＳ分析（图１６）。模型中同一品种的不同产地之间黄芪比较离散，而同一产地间相对集中。蒙古黄芪（ａ）的地域差异比较明显；膜莫黄苠的地域差异也比较明显（ｂ）．东北三省的栽培黄芪分布集中，甘肃的栽培黄芪与和河北的差异小，山东栽培黄芪也与其它产地有显著差异．野生黄芪不同产地差异较大。福建农林大学硕上学位论文第四章讨论与结论ｌ讨论（１）代谢组学技术研究的是机体代谢产物的小分子化合物比较研究，是基因表达的最终产物，而分子标记技术是在基因水平上研究机体的区别，从基因到代谢产物之间可能有许多步骤，会受到环境，机体的发育状态等等的影响，所以分子标记技术和代谢组学技术并不一定完全一一对应，我们的结果显示ＡＦＬＰ和Ｃａ２．ＴＯＦ／ＭＳ区分的总体趋势是一致的。（２）从黄芪基因组ＤＮＡ提取结果（图１）看，基因组ＤＮＡ降解比较严重，这可能与材料相关，材料是室温下贮藏的经干燥粉粹的的黄芪。通过ＡＦＬＰ后面的操作，如酶切、连接及扩增其结果可以看出，基因组ＤＮＡ降解对后面步骤地影响较小。（３）在选择性扩增引物的筛选（图５）过程中可以看出，不同的引物之间差异比较大，扩增效率不同，有的清晰主带比较多（如Ｍ３３．Ｅ４１），而有的引物对相对清晰的主带比较少（如Ｍ３８一Ｅ３７）。挑选清晰主带比较多，且差异条带相对多的引物对用于扩增。通过筛选，从２８对选择性扩增引物中挑选出１１对进行选择性扩增，在进行数据统计时，统计品种和地域差异明显的条带，忽略那些差异条带比较弱，且相互之间混乱的不显著条带。ＰＡＧＥ数据统计方面可能存在误差。对多数供试样品条带清洗可见或没有，差异比较明显的条带，有少数样品比较模糊的条带判断不准。（４）从利用分子标记技术（ＡＦＬＰ）和利用ＧＣ－ＴＯＦ／ＭＳ代谢组学分析技术得到的结果看，不同来源黄芪的品种差异非常明显，ＵＰＧＭＡ聚类（图７）和软件（图９、１３）的分析结果都能把多数供试材料通过品种差异而分开，只有少数出现交叉。从地域差异（图７、１１、１６）分析得出结论是，膜荚黄芪的地域差异非常显著，而蒙古黄芪的出现交叉混杂，这可能与当地气候条件有关，供试膜荚黄芪的地域差异都非常大，从东北三省，到华北地区，再到黄土高原地区等等，气候变化比较显著，从而导致膜荚黄芪的分组相对比较明显；而采集的蒙古黄芪的地域差异相对较小，主要集中在黄土高原地区，不同采集来源的气候差异变化不大，因而分组不明显，出现交叉混杂。（５）出现少部分样品的品种混杂，同一采集地的出现差异，可能与栽培品种间混杂有关，在栽培过程中，栽培品种之间可能会出现相互杂交，导致出现同一产地相互之间也有差异。在同一地区的野生品种之间也可能出现相互混杂现象。４２福建农林大学硕士学位论文２结论（１）从ＵＰＧＭＡ聚类分析（图７）结果看，利用ＡＦＬＰ技术基本上能够区分黄芪的两个不同品种蒙古黄芪和膜荚黄芪，而且地域特性显著。例如，山东与河北的栽培膜荚黄芪聚类比较集中，吉林四平和吉林通化的栽培膜荚黄芪聚类分析的距离非常小；甘肃岷县和甘肃宕县的栽培膜荚黄芪聚类结果比较相近。蒙古黄芪的聚类结果，地域不太集中，东北三省膜荚黄芪的聚类在比较相同。山西应县野生蒙古黄芪，山西浑源、内蒙古固阳栽培蒙古黄芪与甘肃栽培蒙古黄芪聚类出现交叉。（２）代谢组学技术分析结果由蒙古黄芪和膜荚黄芪的脂相（图８）和水相（图１３）可以直观的看出两个不同品种黄芪的区分比较明显，仅有少数样品交叉。从蒙古黄芪地域差异（图１１－ａ，１６．ａ）看，吉林汪清的栽培蒙古黄芪脂相与其他的蒙古黄芪脂相差异较大，甘肃漳县的野生蒙古黄芪脂相与其他产地的蒙古黄芪腊相差异也非常显著，甘肃漳县野生黄芪水相与山西浑源栽培黄芪水相、内蒙古固阳栽培黄芪水相远离。从膜荚黄芪地域差异（图ｌ１－ｂ，１６－ｂ）看出，地域区别比较显著，吉林四平和吉林通化的膜荚黄芪脂相非常接近，山东菏泽和河北保定的栽培膜荚黄芪脂相比较接近，甘肃漳县栽培膜荚黄芪和甘肃渭源的野生蒙古黄芪脂相差异较小。黑龙江鹤岗、吉林四平与吉林通化膜荚黄芪水相相对比较集中，山东菏泽与山东淄博的膜荚黄芪水相比较相近，甘肃宕县、甘肃岷县与河北保定的膜荚黄芪水相差异较小。野生产地（图ｌａｂ）甘肃漳县野生膜荚黄芪水相与黑龙江鹤岗野生膜荚黄芪水相与其他产地栽培膜英黄芪水相的差异比明显。（３）综合分子标记技术（ＡＦＬＰ）和利用ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ代谢组学分析技术得到的结果，可以得出这样的结论，利用这两种分析技术对１９个不同产地的蒙古黄芪和膜荚黄芪进行分析，都能够将这两个品种区分开来：从地域区分来看，利用这两种分析技术都得出，各个地域的膜荚黄芪都比较集中，地域差异比较明显，而各个地域蒙古黄芪的差异相对模糊，各个地域出现交叉，野生黄芪的地域差别更显著。这两种分析结果趋于一致。利用分子标记技术（ＡＦＬＰ）和利用ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ代谢组学分析技术分析，虽然基本取得预期的结果，得到了一些有意义的结论，为下一步的研究提供了有益的信息，但是还不能完全鉴别黄芪的品种和产地。我们可以进一步深入研究，通过分子标记技术（ＡＦＬＰ）找出品种间和地域间的特异性条带，利用ＧＣ．ＴＯＦ／ＭＳ代谢组学分析技术鉴定出品种间和地域间的代谢标识物，用于快速鉴别材料的品种和地域。４３福建农林大学硕上学位论文参考文献【Ｉ】国家药典委员会编．中华人民共和国药典２００５年版一部［ＭＩ．北京：化学工业出版社，２００５．【２】赵一之．黄芪植物来源及其产地分布研究．中草药明，２００４，３５（１０）：１１８９·１１９０．【３】傅坤俊，张振万，何善宝，ｅｔａ１．中国植物志第四十二卷第一分册【Ｍ】．北京：科学出版社，１９９３．［４】朱相云，陈家瑞．黄苠属一新改级．植物研究【Ｊ】，１９９５，１５（Ｉ）：５０·５１．【５】朱相云，陈家瑞．黄芪属一新改级．植物研究【Ｊ】，１９９５，３２（６）：１２０３－１２０４．【６】王尔彤，刘鸣远．两种药用黄芪比较生物学研究．植物研究【Ｊ】，１９９６，１６（８５—９１．【７】索贞，任敏，周好田．黄苠的化学成分及现代药理．现代医院【Ｊ】，２００５，５（９）：８５－８６．［８】王艳芳，鲍建材，郑友兰，ｅｔａ１．黄芪的研究概况．人参研究【Ｊ】，２００４，１）：１０－１６．【９】祁太平等．黄芪甙治疗传染性肝炎疗效的观察．新医药学杂志［Ｊ】，１９７３，８）：２４．【ｌＯ】中国医学科学院药物研究所．防治感冒及气管炎中草药手册［Ｍ】．北京：人民卫生出版社，１９７６：１２．【ｌｌ】叶丽南．复方黄芩注射液对病毒性，化脓性，炎症性眼病的疗效报告．新医药学杂志川，１９７３，３）：２７．【１２】湖南医学院第二附属医院眼科．黄芪治疗沙眼．中草药通讯明，１９７８，３）：３３．【Ｉ３】ＱｉＺｏｎｇｓｈａｏ．ＳｕｍｍａｒｉｚｅａｎｄＨｅｒｂａｌｏｆｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＤｒｕｇｓ，１９８７，１８（５）：２３３·２３５．【１４】中国药材公司．中国中药规划［Ｍ】．北京：科学出版社，１９９５：６８，４８６．【１５】张庆芝，吴晓俊，刘涤，ｅｔａ１．黄芪及其民间惯用品ＤＮＡ指纹图谱和有效成分含量的比较．中国药学杂志［Ｊ】，２００５，４０（６）：４５７－４５９．【１６】叶福嫒，毛泉明，张蕾，ｅｔａ１．不同品种黄芪中的氨基酸和微量元素含量的比较．时珍国医国药［Ｊ】，２００５，１６（９）：８５１－８５２．［１７】饶伟文，王宝琴．黄芪类中药中芒柄花素和毛蕊异黄酮的ＨＰＬＣ测定．中成蓊【Ｊ】，１９９１，１９（３）：３２·３３．【１８】史刚荣，．黄芪复合体（豆科）核型资料的聚类分析．植物研究［Ｊｌ，２００３，２３（２）：２２０—２２３．【１９】史刚荣．膜荚黄芪和蒙古黄芪雌雄配子体及胚胎发育的比较研究【Ｍ】．兰州：西北师范大学硕士学位论文，２０００．【２０】白效令，王湘，张莉，ｅｔａ１．黄苠超微结构观察及其脂酶周工酶比较．中草药【Ｊ】，１９９４，２５（９）：４７９－４８１．【２ｌ】谢开智．黄芪与伪品黄芪的鉴别．海峡药学【Ｊ】，２００１，１３（３）：３７．【２２】张杰．黄芪与地区用药及伪品的鉴别．广东药学［Ｊｌ，２００２，１２（６）：２６·２７．【２３】王俊杰，张红霞，金雄．蒙古黄芪与膜荚黄苠种子形态特征及其鉴别方法的研究．中草药忉，２００５，３６（７）：１０７２－１０７５．【２４】张海英．黄苠的真伪鉴别．中华中医药学刊［Ｊ］，２００７，２５（５）：１０５３－１０５４．【２５］张磊，姜红，聂磊，ｃｔａ１．中药黄琵鉴别方法的研究进展．中药材［Ｊｌ，２００８，３１（００４）：６２０—６２４．［２６】ＰｉｔｅｒＶｏｓ，ＲｅｎｅＨｏｇｅｒｓ，ｅｔａ１．ＡＦＬＰ：ａｎｅｗｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．ＮｅｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２３（２ｎ：４４０７４４１４．【２７】ＺａｂｅａｕＭ，ＶｏｓＰ．ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＥｕｒｏｐｅａｎｐａｔｅｎｔｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｇｅｎｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｄｎｆｉｎｇ．ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］，ｌ９９３，９２４０２６２９（７）．ＩＳ，ＬｉｎＣＣ，ｅｔａ１．ＰｏｓｓｉｂｌｅＩｏｅｍｉｏｎｏｆａ［２８】ＨｏｏＪＪ，Ｓａｌａｆｓｋｙｒｅｃｅｓｓｉｖｅｔｅｓｔｉｓｆｏｒｍｉｎｇｇｅｎｅｏｎ９ｐ２４．ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ［ｆｌ，１９８９。４５：Ａ７８．【２９】ＮａｓｒｉｎＮ，ＢｕｇｇｓＣ，ＫｏｎｇＸＦ，ｅｔａ１．ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｏｆｔｈｅｔｅｓｔｉｓ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｇｅｎｅａｎｄｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ［Ｊ］，１９９１，３５４（６３５１）：３ｌ７－３２０．［３０１ＯｒｉｔａＭ，ＳｕｚｕｋｉｒＳｅｋｉｙａ￡ｅｔａｉｊＲａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］，１９８９，５（４）：８７４－８７９．【３ｌ】韩双艳，郭勇．ＡＦＬＰ在分子生物学研究中的应用．生物技术通报［Ｊｌ，２００１，００２）：２２—２４．【３２】王斌，翁曼丽．ＡＦＬＰ的原理及其应用．杂交水稻【Ｊ】，１９９６，００５）：２７－３０．【３３】翁跃进．ＡＦＬＰ一一种ＤＮＡ分子标记新技术．遗传［Ｊ】，１９９６，１８（００６）：２９－３１．福建农林大学硕士学位论文【３４】周廷清．ＤＮＡ分子标记技术在植物研究中的应用【Ｍ】．北京：化学工业出版社，２００５：【３５】黄璐琦．分子生药学【Ｍ】．北京：北京医科大学出版社，２０００：１７９．２２４．【３６】ＤｅｂｅｎｅｒＴ，ＭａｔｔｉｅｓｃｈＬＴＡＧＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐｆｏｒ脚ｕｓｉｎｇｂａｓｅｄＲＡＰＤａｎｄＡＦＬＰｍａｒｋｅｒｓ．ａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］，１９９９，９９（５）：８９１·８９９．ａ１．ＬｉｎｋａｇｅｍａｐｏｆＪａｐａｎｅｓｅｂｌａｃｋｐｉｎｅｏｎ【３７】ＨａｙａｓｈｉＥ，ＫｏｎｄｏＬＴｅｒａｄａｋｅｔＡＦＬＰａｎｄＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍａｒｋｅｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｔｈｅｐｉｎｅｎｅｅｄｌｅｇａｌｌｍｉｄｇｅ．ＴＡＧＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］，２００１，１０２（６）：８７１—８７５．【３８】王竹林，刘曙东，刘惠远，ｃｔａ１．‘百农６４…京双１６．，Ｊ、麦遗传连锁图谱构建．西北植物学报们，２００６，２６（００５）：８８６—８９２．【３９】张磊，黄蓓蓓，开国银，ｅｔａ１．中国红花遗传多样性的ＡＦＬＰ分子标记．药学学报明，２００６，４１（００１１：９ｌ－９６．【４０】闰志峰，张本刚，张昭，ｅｔａ１．珍稀濒危药用植物黄檗野生种群遗传多样性的ＡＦＬＰ分析．生物多样性叨，２００６，１４（６）：４８８－４９７．【４ｌ】王利，邢世岩，杨克强，ｅｔａ１．银杏观赏品种遗传关系的ＡＦＬＰ分析．遗传学报阴，２００６，３３（０１１１：１０２０—１０２６．［４２】赵微平．植物基因组：构建、表达和调节【Ｍ】．北京：首都师范大学出版社，１９９６．ｆ４３】马小军，汪小全，人参农家类型的ＡＦＬＰ指纹研究．中周中药杂志阴，２０００，２５（０１２）：７０７．７１０．【４４】杜娟，马小军，李学东．半夏不同种质资源ＡＦＬＰ指纹系谱分析及其应用．中国中药杂志［Ｊ】，２００６，３ｌ（００１）：３０－３３．［４５】唐晓清，王康才，陈暄，ｅｔａ１．丹参不同栽培农家类型的ＡＦＬＰ鉴定．药物生物技术［ｒ／，２００６，１３（００３）：１８２一１８６．［４６】ＶａｎｔｏａｉｇｅｎｅｔｉｃｓＴＴ，ＰｅｎｇＪＱ，ＳｔＭａｒｔｉｎＳ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｖｅｒ－ｓｔａｉｎｉｎｇＡＦＬＰｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｓｏｙｂｅａｎ．Ｓｏｙｂｅａｎｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ（ｕｓＡ）［Ｊ】，１９９６，２３（２０６．２０９．［４７】韩建萍，王永炎，张文生，ｅｔａ１．扩增片段长度多态性标记技术应用于药用植物种质资源研究的前景．广州中医药大学学报［Ｊ】，２００６，２３（００４）：３５２．３５５．【４８】刘勋甲，郑用琏，尹艳．遗传标记的发展及分子标记在农作物遗传育种中的运用．湖北农业科学【Ｊ】，１９９８，１（３３－３５．【４９】ＫＷＪＧ，ＲＫ～ＫＪＬ．ＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙａｒｂｉｔａｒｙｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｕｓｅｆｕｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ［Ｊ］，１９９０，１８（６５３１－３５３５．【５０】ＣＣＨ，ＹＣＣ，ＦＹＺ．ＧｅｎｅｔｉｃａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｉｎｓｅｎｇａｎｄｏｔｈｅｒｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｉＳｉｎ［Ｊ］，２００３，２４（９）：８４１—８４６．［５ｌ】邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记【Ｍ】．北京：科学出版社，２００１：１６－４７．【５２】ＨＪＮ，ＪＹＵ，ＳＣＫ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌＡｓｔｒａｇａｌｉｒａｄｉｘｂｙＲＡＰＤａｎａｌｙｓｉｓ．ＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏＬＩｍｒｎｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ［Ｊ］，２００４，２６（２）：２６５—２７２．ａｔ【５３】ＹｉｐＰＹ，ＫｗａｍＨＳ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｌｏｃａｌｉｔｙｌｅｖｅｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｔｈｎｏｐｈａｒｍａｅｏｌｏｇｙ［Ｊ］，２００６，１０６（２）：２２２—２２９．［５４】张曦，徐青，黄璐琦，ｅｔａ１．中药材黄芪的ＤＮＡ指纹图谱鉴别．世界科学技术．中药现代化［Ｊ】，２００６，８（３）：３３－３６．【５５】吴松权，孙丽娜，王立平，ｅｔａ１．黄芪亲缘关系的ＲＡＰＤ分析．江苏农业科学明，２００７，１）：１４４．１４５．【５６】ＥＺ，ＡＲＤＬ．Ｇｅｎｏｍｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｂｙｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ．ｒｅａｃｔｉｏｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］，１９９４，２０（１７６一１８３．【５７１ＭＤＴ．Ｔｅｍｐｌａｔｅｍｉｘｉｎｇ：ＡｍｅｔｈｏｄｏｆｅｎｈａｎｃｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆｃｏｄｏｍｉｎａｎｔＲＡＰＤｍａｒｋｅｔｓ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ［Ｊ］，１９９５，９１（４）：５８２—５８８．［５８】ＳＨＤ．ＲａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡｓａｎｄｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ：ｗｈａｔａｒｅｔｈｅｙ，ａｎｄｃａｎｔｈｅｙｔｅｌｌａｎｙｔｈｉｎｇ４５福建农林大学硕士学位论文ＷＣｄｏｎ’ｔａｌｒｅａｄｙｋｎｏｗ．Ｅｎｔｏｍ０１．Ｓｏｃ．Ａｍ【Ｊ】，１９９４，８７（６）：７１７－７２２．【５９】ＦＩＥＨＮＯ．叨．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ．２００１，２（３）：１５５·１６８．【６０】ＮｉｃｈｏｌｓｏｎＪＫ，ＬｉｎｄｅｎＪＣ，ＨｏｌｍｅｓＥ．‘Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ’ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｌｉｖｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓｔｏｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｉｍｕｌｉｖｉａｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＮＭＲｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ，ｈｔａ［Ｊ］．Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ，１９９９，２９（１１）：ｌ１８１－１１８９．【６Ｉ】ＬｉｎｄｅｎＪＣ，ＨｏｌｍｅｓＥ，ＮｉｃｈｏｌｓｏｎＪＫ．Ｓｏｗｈａｔ’Ｓｔｈｅｄｅａｌｗｉｔｈｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ【Ｊ】．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００３，７５（１７）：３８４Ａ一３９Ｉ√Ｌ【６２】ＮｉｃｈｏｌｓｏｎＪＫ，ＷｉｌｓｏｎＩＤ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ‘ｇｌｏｂａｌ’ｓｙｓｔｅｍｓｂｉｏｌｏｇｙ：ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｉｎｕｕｍｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ【Ｊ】．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ，２００３，２（８）：６６８－６７６．【６３】ＦｉｅｈｎＯ．Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ—ｔｈｅｌｉｎｋｋｔｗ嘲Ｉｇｅｎｏｔｙｐｅｓａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ，２００２，４８（１—２）：１５５．一１７１．【“】孙向明，杜娟，南莉莉．代谢组学中代谢指纹分析技术进展叨．食品与药品，２００８年第ｌＯ卷第０９期６２．６５．【６５】郭宾，戴仁科．代谢组学及其研究策略和分析方法进展川．中国卫生检验杂志，２００７，１７（３）：５５４．５６３．［６６】ＤｕｍａｓＭＥ，ＣａｎｌｅｔＣ，ＡｎｄｒｅＦ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇ１Ｈ－”ＣＨＭＢＣ—ＮＭＲｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐａｔｔｅｒｎｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｆｉｌｔｅｒｅｄｖａｒｉａｂｌｅｓ【Ｊ】．ＡｎａｌＣｈｅｍ。２００２ｔ７４（１０）：２２６１－－２２７３．［６７】ＱｉｎＨＬ，ＺｈａｎｇＪＸ，ＷａｎｇＺＴ，ｅｔａｌ．Ａａｌｙｓｉｓｏｆ１Ｈ－ＮＭＲｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｓｔｅｍｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ［Ｊ】．ＣｈｉｎａＪＣｈｉｎＭａｔｅｒＭｅｄ，２００２，２７（１２）：９１９—９２３．［６８】ＱｉｎＨＬＺｈａｏＴＺ．ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓｂｙＯＨ—ＮＭＲ【Ｊ】．ＡｅｔａＰｈａｒｍＳｉｎ，１９９９，３４（Ｉ）：５８·６２．［６９】ＷａｒｄＪＬ，ＨａｒｒｉｓＣ，ＬｅｗｉｓＪ，ｅｌａ１．ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＨＮＭＲｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓ嬲ａｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｏｆａｍｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ【Ｊ】．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，６２：９４９—９５７．［７０】袁湘林，张玉奎，邹汉法．基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于中草药黄芪鉴别的研究．药物分析杂志川，２００１，２ｌ（１）：７·１０．［７１】ＫＳｅ，ＲＡＤ，Ｌｗ．ＰｌａｎｔＭｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ［Ｍ］．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版，２００６：［７２】ＬｉａｎｇＹｚ，ＸｉｅＰＳ，ＣｈａｒｔＫ．Ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｈｅｒｂａｌｍｅｄｃｉｎｅｓ［Ｊ］．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ，２００４，８１２（Ｉ一２）５¨０．［７３】ＸｉｅＰＳ，ＣｈｅｎＳＢ，ＬｉａｎｇＹＺ，ｅｔａ１．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔａｎａｌｙｓｉｓｒａｔｉｏｎａｌａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｑｕａｌｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ【Ｊ】．Ｊ，ＣｈｌｏｍａｔｏｇｒＡ，２００６，１１１２（１—２）：１７Ｉ—１８０．【７４】孙捷，孙凯云，孙光．薄层色谱法鉴别伪品黄芪注射液．时珍国医国药【Ｊ】，２００４，１５（６）：３４５．３４６．【７５】金芳，俞明霞，顾凯．黄芪的薄层色谱荧光鉴别．中国中药杂志［Ｊ】，２００２，２７（９）：７１１．７１２．［７６】ＺｈｏｕＺｈｉｆｅｎｇ，ＳｈｅｎＪｕｗｅｎ，ＧｏｎｇＦａｎ，ＱＩＵＸｉｍｉｎ，ＳｔｕｄｙｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌａｎｄｉｔｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ，ＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｄＨｅｒｂａｌＤｒｕｇｓ，２００４，３５（１）．【７７】洪筱坤，王智华．柴胡属１９种植物挥发油的气相色谱一相对保留值的指纹分析．药学学报明，１９８８，２３（１１）：８３９—８４５．【７８】王智华，洪筱坤，包雪声．进Ｉ＝１檀香木的ＧＣ比较分析．中国中药杂志Ⅲ，１９９１，１６（ｉ）：４０－４３．【７９】洪筱坤，王智华，朱孝云．庸香质量标准初探．中国中药杂志【Ｊ】，１９９１，１６（４）：２３０．２３２．［８０】ＭａＸ，ＳｈｉＱ，ＤｕａｎＪ，ｅｔａ１．ＣｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲａｄｉｘａｓｔｒａｇａｌｉ（Ｈｕａｎｇｑｉ）ｉｎＣｈｉｎａ：ａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ［Ｊ］，２００２，５０（１７）：４８６１－４８６６．［８Ｉ】赵健雄，封士兰，胡芳弟．中药材黄芪与红芪的色谱鉴别法．分析测试技术与仪器［Ｊ］，２００５，１１（１）：４６．５０．【８２］ＬｅｎｚＥＭ，ＷｉｌｓｏｎＩＤ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ【Ｊ】．ＪＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓ，２０ｃｒ７；６：４４３＿＿４５８．［８３１ＬＷＱ，ＱＴＹＰＬ．ＱｕａｌｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＲａｄｉｘＡｓｔｒａｇａｌｉｔｈｒｏｕｇｈａｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｉｘｍａｊｏｒａｃｔｉｖｅｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓａｎｄｆｏｕｒｍａｉｎｓａｐｏｎｉｎｓｂｙｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｄｉｏｄｅａｒｒａｙａｎｄｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｄｅｔｅｃｔｏｒｓ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ【Ｊ】＇２００６，ｌｌ３４（１－２）：１６２－ｌ６９．福建农林大学硕上学位论文【８４】ＬＺＬ，ＸＧｒｏｏｔｓＨ，ＭＬ．Ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｍｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｏｎｇｈｏｌｉｅｕｓａｎｄＡ．ｍｅｒｎｂｒａｎａｃｅｕｓ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒｉｎｔｈｅｏｆｔｈｅＮＪ】，２０００，８７６（１·２）：８７－９５．【８５】ＱＸ，ＭａＬＸ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅｓｔａｎｄｅｍａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅｌｒｏｏｔｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｐｐ．ｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｈｅｍｉｃａｌｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ［Ｊ］，２００７，８（７）：４１９－４２７．Ｒ【８６】ＰｌｕｍｂＳ，ＳｔｕｍｐｆＣＬ，ＧｒａｎｇｅｒＪＨ，ｅｔａ１．Ｕｓｅｏｆｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔｉｍｅ，－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｐｒｏｍｉｓｅｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｒｕｇｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｌｕｉｄｓ［Ｊ］．ａｎｄｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｓＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ，２００３，１７（２３）：２６３２－２６３８．ＲＳ，ＳｔｕｍｐｆＣｔｏ【８７】ＰｌｕｍｂＬ，ＧｏｒｅｎｓｔｃｉｎＭＶ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ：ｔｈｅｔＬｇｅｏｆｅ｜ｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｌｉｑｕｉｄｃｏｕｐｌｅｄｒｅｖｅｒｓｅｄ—ｐｈａｓｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｈｏｗｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｒａｔｕｒｉｎｅｉｎｄｒｕｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ明ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎ【８８】ＨａｒａｄａＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ，２００２，１６（２０）：１９９１—１９９６．ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＫ，ＦｕｋｕｓａｋｉＥ，ＫｏｂａｙａｓｈｉＡ．ｅｔａ１．Ｐｒｅｓｓｕｒｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒＯｐｈＯｒｅｓｉｓｕｓｉｎｇｅｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌａｒｉｔｙｒｅｖｅｒｓｉｏｎＢｉｏｅｎｇ，２００６，１０１（５）：４０３－４０９．ａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃｆｌｏｗｆｏｒｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓａｎｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ】．Ｂｉｏｓｃｉ【８９】ＤｅｔｔｍｅｒＫＡｒｏｎｏｖＰＡ，ＨａｍｍｏｃｋＢＤ．Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ【Ｊ１．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ２００７：２６：５ｌ一７８．Ｒｅｖ，［９０】ＡＪ，ＴｒｙｇｇＪ，ＧｕｌｌｂｅｒｇＡｎａｌＪ，ｅｔａ１．ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＧＣ／ＭＳａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｂｌｏｏｄｐｌａｓｍａｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ【Ｊ】．Ｃｈｅｍ，２００５：７７：８０８６－－－８０９４．Ｏ，Ｋｏｐｋａ【９ｌ】ＲＯＥＳＳＮＥＲＵ，ＷＡＧＮＥＲＣ，ＫＯＰＫＡＪ，ｅｔａｌ．【Ｊ】．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２０００，２３（１）：１３ｌ—１４２．】【９２】ＦｉｅｈｎＪ，ＤｏｒｍａｎｎＰ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｆｏｒｐｌａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，ｌ８（１ｎ：ｌｌ５７－１１６１．Ｃ，ＫｏｐｋａＪ，Ｔｒｅｔｈｅｗｅｙ【９３】ｇｏｅｓｓｎｅｒＵ，ＷａｇｎｅｒＲａ，ＷｉｌｉｍｉｔｚｅｒＬ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌａｄｖａｎｃｅ：ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｐｏｔａｔｏｔｕｂｅｒｂｙｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ【Ｊ】．ＰｌａｎｔＪ．２０００，２３：１３１－１４２．【９４】ＡｄａｈｃｈｏｕｒＭ，ＢｒａｎｔＭ，Ｂａｉｅｒｒａｐｉｄ－ｓｃａｎｎｉｎｇｑｕａｄｒｕｐｏｌｅＨＵ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｔｏｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００５：１０６７：２４５－－２５４．【９６】Ｏ’ＨａｇａｎＳ，ＤｕｍａＷＢ，ＫｎｏｗｌｅｓＪＤ，ｅｔａ１．Ｃｌｏｓｅｄ－ｌｏｐ，ｍｕｌｔｉ－ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍａｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒ￥ｅｇｕｍｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ【Ｊ】．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００７：７９：４６４＿—４７６．【９７１ＫｕｌａｒａｅｒｒｏｒｓＴ。Ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ—ｎａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃｕｒｉｎａｒｙｍｅｔａｂｏｌｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｔｏｓｔｕｄｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆｉｎｂｏｒｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍＲｅｖ，２００５：２４：８１４—＿８２７．ｓｙｎｄｒｏｍｅｕｓｉｎｇ【９８】ＯｈｄｏｉＣ，ＮｙｈａｎＷＬ，ＫｕｈａｒａＴ．ＣｈｅｍｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＬｅｓｃｈ—Ｎｙｈａｎｍａｓｓｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，２００３：７９２：１２３一１３０．ｏｒｉｇｉｎｗｉｔｈ【９９】ＭｅｎｄｅｓＰ．［Ｊ］．ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００２，３（２）：１３４—１４５．［１００】ＷｏｏｎｅａｒＹＡ，ＫｉｍＨＪ，ＣｈｏＪＨ，ｅｔａ１．Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｉｎｆｒａｒｅｄｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄＡｎａｌ［Ｊ］，１９９９，２１（２）：４０７－４１３．［１０１】ＷｏｌｄＳ．Ｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙｍｅａｎｓｏｆｄｉｓｊｏｉｎｔｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｍｏｄｅｌｓ．Ｐａｔｔｅｒｎｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］，１９７６，８（３）：１２％１３９．【１０２１孙素琴，汤俊明，袁子民，ｃｔａ１．地道山药红外指纹图谱和聚类分析的鉴别研究．光谱学与光谱分析叨，２００３，２３（００２）：２５８—２６１．【１０３】史春香，杨悦武，郭治听，ｅｔａ１．近红外技术鉴别黄芪产地．天津药学【Ｊ】，２００６，１８（００１）：１９－２１．【１０４】Ｃ．Ｌ．Ｇａｖａｇｈａｎ，Ｅ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｌｅｎｚ，ｅｔａ１．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２０００，（４８４）：１６９．【１０５】颜子颖，王海林译．精编分子生物学指南【Ｍ】．北京：科学出版社，２００１．【１０６】ＶｏｓＰ，ＨｏｇｅｒｓＲ＇ＢｌｅｅｋｅｒＭ，ｅｔａ１．ＡＦＬＰ：ａｎｅｗｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］，４７福建农林大学硕上学位论文１９９５，２３（２Ｉ）：４４０７－４４１４．【１０７】ＺａｂｅａｕＭ，ＶｏｓＰ．Ｅｕｒｏｐｅａｎｐａｔｅｎｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｎｏ．ＥＰ［Ｊ］，１９９３，５３４—５３８．【１０８】卢圣栋．现代分子生物学实验技术【Ｍ】．北京：北京医科大学协和医科大学出版社，１９９９．【１０９】萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯．分子克隆实验指南（第二版）【Ｍ】．北京：科学出版社，１９９６．【ｌｌＯ】刘进元．分子生物学实验指导【Ｍ】．北京：清华大学出版社，２００２．【ｌｌｌ】Ｍ．Ｊ，Ｓａｍｅｔ．分子生物学实验室工作汉英图解指南【Ｍ】．北京：科学出版社，２００４．［１１２］ＲｏｓｋａｍｓＪ．分子生物学实验参考手册：基本数据、试剂配制及其相关方法［Ｍ】．北京：化学工业出版社，２００５：６９．【１１３】赵贬力，马学斌，韩为东．分子生物学基本实验技术仁【Ｍ】．北京：清华大学出版社，２００６．［１１４】内宫博文，田仲可昌，杉浦昌弘，ｅｔａ１．植物基因工程技术【Ｍ】．上海：上海科学技术文献出版社，１９８７，３．【１１５】邹喻苹，汪小全．几种濒危植物及其近缘类群总ＤＮＡ的提取与鉴定．植物学报：英文版【Ｊ】，１９９４，３６（００７）：５２８·５３３．【ｌ１６】ＭｕｒｒａｙＭＧＴｈｏｍｐｓｏｎＷＦ．Ｒａｐｉｄ１９８０，８（１９）：４３２１－４３２５。【１１７】曹晖，毕培曦。中药材苦地胆的ＤＮＡ指纹鉴定．中药材［ＩＩ，１９９６，１９（０１２）：６０８－６１２。【１１８】常青，周开亚．分子进化研究中系统发生树的重建．生物多样性明，１９９８，６（００１）：５５．６２．【ｌ１９】ＬｙｎｃｈＭ：ＴｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｉｎｄｅｘｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｐｌａｎｔＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ［／］，ａｎｄＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ＳＭＢＥ，１９９０，ｐｐ４７８－４８４．【１２０】吴松权等．黄芪亲缘关系的ＲＡＰＤ分析．江苏农业科学，２００７，ｌ，１４４—１４５４８福建农林大学硕士学位论文致谢三年的研究生学习生涯即将结束之即，我的思绪万千，心情也久久不能平静。在此，特别感谢，我的导师潘大仁教授和师母周以飞教授，还有我的母校福建农林大学和所在学院作物科学学院，是潘老师和周老师给了我在福建农林大学和作物科学学院继续深造的机会，潘老师和周老师在生活和学习上给了我奠大的支持和帮助在论文修改上也倾注了潘老师的大量心血。本论文是在我的导师福建农林大学潘大仁教授和中国科学院植物研究所信号转导与代谢组学研究中心漆小泉研究员的共同指导下完成的。潘老师时常跟我讨论实验方面的问题，给我许多建解和指导，还经常询问我的生活和工作问题，在思想上和生活上都给了我很大的鼓舞和支持。在实验过程中，漆老师的指导以及漆老师分析科学问题的方法和对科研工作的见解给予了我极大的启发，令我受益匪浅。在此，我向两位老师致以最诚挚的谢意！感谢中国科学院植物研究所信号转导与代谢组学研究中心次生代谢及抗病创新研究组的副研究员周江鸿老师，助理研究员赵素珍老师、薛哲勇博士。博士研究生赵松子、王丽娟、张雷、徐霞、谢丽霞，硕士研究生王珍、首小花、李明、王亚军、迟旭和龚小平等人在实验上的指导和帮助。尤其感谢助理研究员段礼新老师在实验上的耐心指导和帮助，在代谢物分析方面离不开段老师的悉心指导和帮助，在论文写作和修改方面也得到了段老师和谢丽霞师姐的帮助。感谢中科院光和作用重点实验室的薛震老师在化学实验上的指导和帮助。感谢福建农林大学实验室的硕士研究生王占成、朱慧丽、谢丹凤、胡金波和博士研究生陈建秋、林生两位师兄以及实验室的其他同学，作物科学学院硕士研究生彭青安、胡荣华，这些同学和师兄在我顺利完成学业的过程中给了我许多帮助；感谢我的朋友段会梅在学习和生活上给予我的支持和帮助。感谢多年来我的家人与关心我的朋友们给予我默默无闻的奉献和一贯的支持与鼓励，才使我有信心和毅力完成全部的学业。路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。我愿在未来的工作和学习过程中，以更加丰硕的成果来答谢曾经关心、帮助和支持过我的所有老师、同学、同事和朋友。谢谢１４９不同来源黄芪的AFLP标记和代谢谱分析

作者：

学位授予单位：

周业庆

福建农林大学

1.期刊论文 杨志方 \"大西北\"牌多元微肥对人工栽培甘草和黄芪药性影响的研究 -微量元素与健康研究2006,23(5)

应用\"大西北\"牌多元微肥系列之\"根、根茎类药用植物专用肥\"在甘草、黄芪生长期进行叶面喷施.经检测,二年生甘草的甘草酸含量,对照组平均1.43%,处理组1.63%,提高了13.98%;三年生甘草的甘草酸含量对照组3.03%,处理组4.68%,提高了54.45%;一年生黄芪甲苷含量对照组0.04%,处理组0.052%,提高了30%;黄芪硒含量对照组0.106 mg/kg,处理组0.780mg/kg,提高635%,黄芪的锰、锌元素也有不同程度的提高.

2.期刊论文 马世震.陈志国.张鼎新.马建民 陇西地区蒙古黄芪不同密度栽培试验研究 -安徽农业科学2004,32(1)

在陇西首阳黄芪人工栽培基地按照海拔、地形和地貌条件的不同,各选取666.67 m2试验样地,按照不同密度设计株行距,统一种苗和田间管理技术进行栽培试验,收获期统一测定黄芪产量和个体特征,利用HPLC方法对不同密度栽培黄芪甲甙含量进行测试.研究结果表明,从黄芪的外观等级、经济效益和黄芪甲甙含量等指标评价,最佳栽培密度为20 cm×20 cm.

3.期刊论文 李忠 人工栽培黄芪的关键技术 -农村实用技术2003,\"\"(10)

黄芪为豆科多年生草本植物,是重要的药用资源.近年来山东威海市人工栽培黄芪技术发展迅速,已成为当地丘陵山区发展高效农业、提高农民收人的好项目.下面谈一下黄芪栽培的关键技术措施.

4.期刊论文 李雪英.丁建国.张执金.张华娟.宋修建 人工栽培黄芪的关键技术 -农业科技通讯2000,\"\"(8)

黄芪为豆科多年生草本植物,是重要的药用资源.近年来山东省威海市人工栽培黄芪技术发展迅速,已成为本地丘陵山区发展高效农业、提高农民收入的好项目.下面谈一下黄芪栽培的关键技术措施.

5.会议论文 刘靖.洪浩.蔡青圆.郭宝林.宗希明.王良信.王臣.陈虎彪 中药黄芪的资源分布与生态习性的调查研究 2006

通过实地考察,调查研究了中药黄芪原植物蒙古黄芪和膜荚黄芪野生及家种的资源分布与生态习性。结果可以看出蒙古黄芪分布较广,资源比较丰富,主要分布于内蒙古自治区、山西省、甘肃省等地区,多为人工栽培,种植在平川地上,仅在山西省恒山地区有分布在向阳山坡上的半野生状态的黄芪资源。膜荚黄芪多野生于黑龙江省及内蒙古自治区东北部,多数野生于向阳山地上且资源不多;陕西省、山东省、河北省、甘肃省等少数地区有引种栽培。近年来我国栽培及商品黄芪主流为蒙古黄芪。

6.期刊论文 吴文星 开发野生蔓性千斤拔的前景及人工栽培技术要点 -中国农村小康科技2005,\"\"(9)

蔓性千斤拔又叫一条根、老鼠尾、透地龙、千斤拔、牛大力、钉地根、土黄芪等,属于多年生豆科蔓性千斤拔属的一种常用药用植物.由于滥采乱挖、只挖不育、自然分布较为零散等原因,造成野生的产量锐减.从1999年以来,蔓性千斤拔的市场销售量逐年增长,价格也稳步上扬.为了保护和开发野生蔓性千斤拔药材资源,从2001年开始对野生蔓性千斤拔进行人工栽培试验,已获得成功.

7.期刊论文 祝显红 称多县退耕还林地黄芪间作套种栽培与管理技术 -现代农业科技2010,\"\"(2)

通过人工模仿野生黄芪的生长条件进行人工栽培,不仅对保护野生黄芪资源具有重要的意义,而且还对进一步巩固退耕还林成果、培育后续产业、增加群众收入有着重要的社会效益和经济效益.为此,介绍了黄芪的栽培与管理技术,以为药农种植提供技术指导.

8.期刊论文 李忠 人工裁培黄芪关键技术 -华夏星火2002,\"\"(6)

黄芪为豆科多年生草本植物,是重要的药用资源.近年来山东省威海市人工栽培苋式技术发展迅速,已成为丘陵山区发展高效农业、提高农民收入的好项目.那么,栽培黄芪的关键技术措施有哪些呢?

9.期刊论文 孙秀荣 无公害黄芪栽培技术 -现代农业2009,\"\"(11)

一、发展无公害黄芪的可行性

山西省五寨县是全省中药材产区之一,不仅具有丰富的野生资源,而且还有人工栽培的传统.五寨县地处国家级自然保护区--芦芽山脚下,境内不仅植被资源丰富,而且生态环境和土壤资源非常适合中药材的生产种植.

10.期刊论文 周德华.张美仙 发展无公害半野生黄芪浅见 -现代农业2004,\"\"(7)

山西省五寨县是全省中药材产区之一,不仅具有丰富的野生资源,而且还有人工栽培的传统.五寨县地处国家级自然保护区--芦芽山脚下,境内不仅植被资源丰富,而且生态环境和土壤资源非常适合中药材的生产种植.

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1512464.aspx

下载时间：2010年6月11日