实用医学进修杂志２０１０年第３８卷第４期ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＲＡＣＴＩｃＡＬＴＲＡＩＮＩＮＧＯＦＭＥＤＩＣＩＮＥＶ０１．３８Ｎｏ．４Ｄｅｃ．２０１０・１９３・ＤＣ与ＣＩＫ及其在肿瘤细胞免疫治疗中的研究进展高开波黄刚三峡大学人民医院［湖北省宜昌市第一人民医院］血液科（湖北宜昌４４３００２）过继细胞免疫治疗（ａｄｏｐｔｉｖｅｃｅｌｌｕｌａｒ证明，ＤＣ可以从骨髓细胞中或外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中诱导产生。ＤＣ最大特点是能够刺激初始型Ｔ细胞活化和增殖，它能把肿瘤细胞抗原有效的呈递给Ｔ细胞，使Ｔ细胞对抗原蛋白酶致敏，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＩ）是指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤或激发抗体免疫反应来杀伤肿瘤细胞达到治疗肿瘤的目的，是一种治疗肿瘤的有效方法。过继细胞免疫对于促进患者免疫系统的重建、消除微小残留病灶（ＭＲＤ）及骨髓净化都有良好的效果。目前用于肿瘤治疗的免疫细胞有淋巴因子激活的杀伤细胞（１ｙｍｐｈｏ．ｋｉｎｅ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ从而杀灭肿瘤细胞。研究表明肿瘤的发生与ＤＣ数量的减少和功能的缺陷关系密切。ＣＩＫ是一种新型的免疫活性细胞，由Ｓｃｈｍｉｄｔ—Ｗｏｌｆ等于ｌ９９１年首次发现，ｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ，ＬＡＫ）、肿瘤浸ｌｙｍ．润性淋巴细胞（ｔｕｍｏｒ—ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ他是将人ＰＢＭＣ在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达ＣＤ３和ＣＤ５６两种膜蛋白分子，故又称为ＮＫ细胞样Ｔ淋巴细胞。ＣＩＫ、ＣＤ３ＡＫ、ＬＡＫ比ｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＴＩＬ）、ＣＤ３单克隆抗体激活的杀伤细胞（ＣＤｌｖａｔｅｄｋｉｌｌｅｒｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｃｔｉ—ｃｅｌｌ，ＣＤ３ＡＫ）、细胞毒性Ｔ细Ｔ胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）、供者淋巴细胞（ｄｏｎｏｒｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＤＬ）、树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）、细胞因子诱导的杀伤细胞（ｃｙｔｉｋｉｎｅＣＩＫ）等。ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒ，较三者虽然均由ＰＢＭＣ诱导而来，但诱导的细胞因子有所不同。ＣＩＫ主要为ＩＮＦ一吖、抗ＣＤ３，单克隆抗体和ＩＬ一２，ＣＤ３ＡＫ主要为抗ＣＤ３单克隆抗体和ＩＬ一２，ＬＡＫ主要为ＩＬ一２。ＣＩＫ、ＣＤ３ＡＫ、ＬＡＫ的增殖能力及抗肿瘤活性依次递ＤＣ是起源于骨髓的专职抗原提呈细胞（ＡＰＣ），是目前所知抗原提呈功能最强的ＡＰＣ，能摄取、加工和提呈抗原，减。三者对肿瘤细胞的杀伤都具有非ＭＨＣ限制性，因而具有杀瘤谱广的特点，然而由于ＬＡＫ的扩增能力有限、抗肿瘤活性低且需要大剂量的ＩＬ一２维持，毒副作用明显，因而在临床上的应用受到限制。供者淋巴细胞输注（ＤＬＩ）临其刺激Ｔ淋巴细胞产生免疫反应能力较其他ＡＰＣ强约ｌ００—１０００倍。Ｉ９７３年Ｓｔｅｉｎｍａｎ和Ｃｏｈｎ首次从小鼠淋巴细胞中分离成功，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。体外细胞培养作者简介：高开波（１９６４一），男，副主任医师。万方数据ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＲＡ（ｍＣＡＬ删ＮＩＮＧ实用医学进修杂志２０１０年第３８卷第４期ＯＦＭＥＤＩＣＩＮＥＶ０１．３８Ｎｏ．４Ｄｅｃ．２０１０・１９４・床应用发生移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）、受者造血不良等不良反应较多。ＴＩＬ细胞分离操作复杂容易造成污染，而且多数肿瘤组织中ＴＩＬ含量很少，导致ＴＩＬ分离培养成功率只有２０％，难以成为常规治疗方法。ＣＩＫ具有增殖能力强、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感及非主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）限制性杀瘤等优点，且对骨髓及造血细胞无明显副作用，成为新一代细胞免疫治疗的首选。ＤＣ和ＣＩＫ是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，前者识别抗原、激活获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保了一个高效和谐的免疫体系。将具有强大肿瘤抗原提呈能力的Ｉ）Ｃ和高效杀伤活性的ＣＩＫ联合应用于治疗恶性肿瘤患者，有助于增强肿瘤患者Ｔ细胞免疫能力，起到抗肿瘤作用。本文就ＤＣ、ＣＩＫ及其在肿瘤细胞免疫治疗中的研究进展进行综述。１ＤＣ的生物学特性１。１ＤＣ起源及分化研究表明，ＤＣ主要来源于骨髓的ＣＤ３４＋细胞，继之人们在血液、淋巴液等亦相继发现并成功分离出ＤＣ，其本质是属于粒系。１．２ＤＣ的分类ＤＣ按其来源可分为髓样ＤＣ和淋巴样ＤＣ。它们均起源于多能造血干细胞。淋巴样ＤＣ主要分布于淋巴结。脾脏、粘膜相关组织中的淋巴滤泡生发中心，主要与Ｂ淋巴细胞功能有关、具有一定的吞噬、摄取、加工抗原的能力，但抗原呈递能力低；髓样ＤＣ主要分布于Ｔ细胞富含区，与Ｔ细胞功能有关，专职抗原呈递。，１．３ＤＣ的免疫表型ＤＣ被定义为系阴性细胞，他们不表万方数据达典型Ｔ细胞、Ｂ细胞、ＮＫ细胞和单核细胞标记；高表达ＭＨＣＩ、Ⅱ类分子，共束０激分子ＣＤ８０（Ｂ７一１）、ＣＤ８６（Ｂ７—２），细胞间粘附分子ＩＣＡＭ一１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ一３（ＣＤ５０）和淋巴细胞功能相关抗原ＬＦＡ一３（ＣＤ５８）等。新报道的一组ＤＣ表型如下：ＣＤｌ仪（＋）、ＣＤ３（一）、ＣＤ４（一）、ＣＤ８（一）、ＣＤｌ４（一）、ＣＤ２Ｏ（一）、ＣＤ４０（一）、ＣＤ８０（＋）、ＣＤ８６（＋）；ＣＤ３（一）、ＣＤ４（一）、ＣＤ８（一）、ＣＤ２２０（一）、ＣＤ４０（＋）、ＣＤ８０（＋）、ＣＤ８６（＋）。至今尚未发现ＤＣ独有的标志。１．４ＤＣ的特点ＤＣ是体内最重要的ＡＰＣ，其特点在于：①能合成大量的ＭＨＣ—Ｉ、ＭＨＣ一Ⅱ类分子；②具有表达摄取和转运抗原的特殊膜受体；③主要通过胞饮作用、受体方式及吞噬方式有效摄取和处理抗原，然后迁移至Ｔ细胞区域，具有一个成熟化的过程；④能激活初始型Ｔ细胞；⑤少量的抗原和少量的ＤＣ即足以激活Ｔ细胞，ＤＣ激活Ｔ细胞的能力是巨噬细胞或Ｂ细胞的１００—１００００倍；⑥ＤＣ在一些激活信号（ＣＤ４０或ＬＰＳ）处理后可产生大量的ＩＬ一１２，后者可以调节Ｔ细胞和ＮＫ细胞功能，促进Ｔｈ０朝Ｔｈｌ方向分化，显著影响Ｔｈｌ、Ｔｈ２的平衡。２ＤＣ抗肿瘤的机制２．１诱导产生大量效应Ｔ细胞ＤＣ可以捕获抗原，并加工为短肽，形成肽与ＭＨＣ复合物，表达于细胞表面而启动Ｔ细胞介导的免疫反应。同时ＤＣ还可以通过分泌或诱导其他细胞分泌ＩＬ—ｌ２而启动ＣＤ４＋Ｔｈ免疫应答，活化的Ｔｈ细胞可通过产生ＩＦＮ一叮、ＧＭ—ＣＳＦ和ＴＮＦ—ＯＬ等细胞因子又正反馈上凋ＤＣ对ＩＬ一１２和共刺激分子的分泌。２．２启动效应细胞Ｔ细胞迁徙至肿瘤实用医学进修杂志２０ｔ０年第３８卷第４期ＪＯＵＩ乇ＮＡＬ０ＦＰＲＡＣⅡＣＡＬ删ＮＩＮＧ０ＦＭＥＤＩＣＩＮＥＶ０１．３８Ｎａ４Ｄｅｃ．２０１０邢位ＤＣ的显著性之一是其具有较强的定向迁徙能力。ＤＣ能通过分泌细胞因子和趋化因子选择性趋化Ｔ细胞，而增加肿瘤部位的效应Ｔ细胞数量。２．３延长效应Ｔ细胞在肿瘤部位存在的时间瘤周的浸润性ＤＣ和Ｔ细胞都由于肿瘤细胞的存在而导致功能障碍或死亡。Ｔｒｏｙ等证明肿瘤浸润性ＤＣ及荷瘤宿主ＤＣ有着与功能成熟ＤＣ不同的表型特征，其膜表面ＭＨＣ分子及某些共刺激分子不表达或表达低。但ＤＣ与Ｔ细胞之间的相互作用以及滤泡型ＤＣ对抗原的保留都可使ＤＣ分泌某些生存因子而促进Ｔ细胞的生长，维持Ｔ细胞反应。２．４抑制肿瘤血管的生成ＤＣ可能通过释放某些抗血管生成物质（如ＩＬ一１２、ＩＦＮ一１）等而影响肿瘤血管的形成。３ＤＣ的临床应用３．１ＤＣ与肿瘤疫苗肿瘤疫苗是肿瘤主动免疫治疗手段之一，一直被人们寄予厚望。目前国外已对黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道肿瘤、妇科肿瘤、内分泌肿瘤及血液肿瘤等进行Ｉ期、Ⅱ期临床试验。ＤＣ是唯一能活化静息Ｔ细胞，诱导初级免疫应答的抗原递呈细胞，既能活化ＣＤ４＋Ｔ细胞，又能活化ＣＤ８＋Ｔ细胞，对于外源性抗原也能通过所谓交叉激活机制诱导出ＭＨＣ—Ｉ类限制性ＣＤ８＋Ｔ细胞。有研究者将ＤＣ与肿瘤细胞融合，引起机体特异性的ＣＴＬ活性，能产生有效的抗肿瘤效应。３．２ＤＣ介导白血病细胞的诱导分化治疗白血病是造血系统的恶性肿瘤。目前采用造ＩＩ：【Ｌ干细胞或骨髓移植治疗白血万方数据・１９５・病，而体内的ＭＲＤ是导致白血病复发的根源。根除ＭＲＤ依靠效应Ｔ细胞对肿瘤抗原的识别以及高效的抗原递呈，最终靠肿瘤免疫来完成。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等报道将２１例急性白血病患者的外周血单核细胞与ＧＭ—ＣＳＦ、ＴＮＦ一仪共同培养，１５例存活的细胞株中有１２例获得具有典型ＤＣ形态细胞，成熟ＤＣ高表达ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＣＤ８３等，ＦＩＳＨ分析证实为急性白血病细胞来源，１２例中有９例产生混合淋巴细胞反应，证实这些由白血病细胞培养产生的ＤＣ具有很强的抗原递呈功能。３．３ＤＣ与多发性骨髓瘤、淋巴瘤董子明等将骨髓瘤细胞与ＤＣ融合制成融合疫苗，在动物研究中发现有明显的肿瘤预防和治疗作用。Ｈｓｕ等用Ｂ细胞淋巴瘤分泌的１ｄ加ＫＬＨ脉冲纯化的ＤＣ，接种４例淋巴瘤病例，均能很好耐受，其中１例完全缓解。对那些微小残留病的淋巴瘤病例，使用ＤＣ为基础的免疫治疗可改善长期预后。４ＣＩＫ的生物学特性４．１增殖能力强大量试验证明ＣＩＫ经ＩＦＮ一１、ＩＬ一２、抗ＣＤ３ＭｃＡｂ和ＩＬ—ｌ仅等因子诱导后，细胞增殖速度加快，远超过ＩＡＫ细胞。有报道称其培养１５ｄ后，ＬＡＫ细胞增殖达１９倍，而ＣＩＫ增殖达７８倍，细胞增殖与其表明表达ＩＬ一２Ｒ和分泌内源性ＩＬ一２有关。至培养的２２ｄ左右，ＣＩＫ增殖曲线达顶峰，约增加１００倍左右。４．２杀瘤活性高ＣＩＫ是以ＣＤ３＋ＣＤ５６＋细胞为主的异质细胞群，较以ＮＫ细胞为主的ＬＡＫ细胞具有更强的杀瘤活性。任欢等在体外试验中发现，ＣＩＫ对肿瘤细胞的杀伤能力及体外增殖能力远高于ＬＡＫ细胞，体内试验中，对于Ｈ２２肝癌腹水瘤动物实用医学进修杂志２０１０年第３８卷第４期ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＲＡ（ｊⅡＣＡＬⅡ认ＩＮＩＮＧＯＦＭＥＤＩＣＩＮＥｖ０１．３８Ｎｏ．４Ｄｅｅ．２０１０・１９６・模型、胃癌及肝癌（ＢＥＬ一７４０２）细胞动物模型研究表明，ＬＡＫ细胞在消除病灶、抑制转移、延长生存方面明显不及ＣＩＫ。Ｓｃｈｍｉｄｔ—Ｗｏｌｆ等研究发现，ＣＩＫ对多重耐药肿瘤细胞同样敏感，Ｍｅｈｔａ等观察到ＣＩＫ杀瘤活性不受免疫抑制剂ＣｓＡ、ＦＫ５０６等的影响。４．３杀瘤谱产ＣＩＫ对多种肿瘤细胞系（包括Ｋ５６２、肝癌细胞系ＢＥＬ一７４０２、胃癌细胞系ＭＧＣ一８０３、胰腺癌细胞系ＤａｎＧ、乳腺癌细胞系ＭＣＦ７）均表现出强大的杀伤活性。这与ＣＩＫ既有Ｔ细胞强大的抗瘤活性，也有ＮＫ细胞的非ＭＨＣ限制性杀瘤特点相关。４．４对正常骨髓造血前体细胞毒性小Ｓｃｈｍｉｄｔ—Ｗｏｌｆ等的研究认为ＣＩＫ对正常骨髓细胞毒性较小，可以保存约７５％以上的ＣＦＵ—ＧＭ集落。ＣＩＫ对正常骨髓抑制可能与ＣＩＫ产生肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、干扰素（ＩＦＮ）、淋巴细胞毒素等细胞因子有关。５ＣＩＫ抗肿瘤的机制５．１直接杀瘤作用Ｍｅｔｈａ等研究认为，ＣＩＫ经过两条途径释放胞浆颗粒，通过颗粒内容物发挥对靶细胞直接杀伤作用。一条是ＣＩＫ识别结构刺激其表面配体ＬＦＡ一１导致颗粒依赖性细胞溶解，该途径对细胞内ｃＡＭＰ水平敏感，而对免疫抑制剂药物ＣｓＡ和ＦＫ５０６有抵抗作用；另一条途径是ＣＩＫ表面的ＣＤ３或类似ＣＤ３受体被激活导致颗粒介导的杀伤作用，该途径对细胞内ｃＡＭＰ水平和免疫抑制剂药物ＣｓＡ和ＦＫ５０６都很敏感。５．２抑瘤杀瘤作用大量试验证明，培养的ＣＩＫ可以分泌多种细胞因子，如ＴＮＦ一仅，ＩＬ一２，ＧＮ—ＣＳＦ，ＩＦＮ一＾ｙ等。不仅对肿瘤细胞有万方数据直接杀伤作用，还可以通过调节抗体免疫系统反应性问接杀伤肿瘤细胞。５．３诱导肿瘤细胞凋亡Ｖｅｒｎｅｒｉｓ等试验提示，ＣＩＫ表达ＦａｓＬ凋亡，能抵抗ＦａｓＬ＋肿瘤细胞引发效应细胞Ｆａｓ—ＦａｓＬ凋亡，又可诱导Ｆａｓ＋肿瘤细胞凋亡，发挥对肿瘤细胞慢性杀伤作用，保证抗肿瘤作用的长期持久。５．４促进Ｔ细胞增殖活化研究表明，ＣＩＫ体内抗肿瘤作用可能与促进宿主体内细胞增殖活化有关，并推测，原始的ＣＤ３＋ＣＤ５６＋细胞随ＣＩＫ输注体内后，在宿主抗体状态或肿瘤抗原刺激下转变成具有杀瘤活性的细胞毒性Ｔ细胞，发挥抗瘤作用。６ＣＩＫ的临床应用６．１ＣＩＫ在血液肿瘤中的应用张乐萍等临床应用ＣＩＫ与ＩＬ一２联合治疗儿童ＡＬＬ。他们选择２８例化疗１２个月后ＭＲＤ仍阳性的儿童ＡＬＬ患者，其中１４例治疗组。另外１４例为对照组。ＣＩＫ的输注方法为：取培养１０ｄ的自体ＣＩＫ，如霉菌、细菌培养阴性，活性＞９５％，分２ｄ通过输血器会输给患者，回输ＣＩＫ的次日起皮下注射５×１０５ＩＵ／Ｄ的ＩＬ一２，共５～１０ｄ，回输细胞数为（８—２７）ｘ１０９个／ｍｌ。每２月进行骨髓形态学、ＭＲＤ检测。结果显示：１４例患者应用ＣＩＫ／ＩＬ一２治疗１～４个疗程，输注过程中无１例出现寒战、发热、过敏。对心肺功能影响不大；输注后外周血白细胞略有升高，血红蛋白和血小板无变化，说明ＣＩＫ具有安全性。治疗组随访５～３３个月无ｌ例复发，生存时问超过３０—５４个月，且骨髓形态学和ＩＭＲＤ检测均为阴性，１例脾大者也于治疗后回缩。对照组８例复发死亡，两组复发率比较差异有显著性。６．２ＣＩＫ在其他肿瘤中的应用实用医学进修杂志２０１０年第３８卷第４期ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＲＡＣＴＩ（认ＬＴＲＡＩＮＩＮＧＯＦＭＥＤＩＣＩＮＥＶｏＬ３８Ｎｏ．４Ｄｅｃ．２０１０陈复兴等报道了应用ＣＩＫ治疗６３例肿瘤患者的近期疗效，其中肝癌ｌ５例，胃癌１４例，食管癌ｌ１例，肺癌６例，乳腺癌５例，其他肿瘤１２例；肿瘤分期为Ⅱ一Ⅳ期。结果：在６３例接收治疗者中，部分缓解（ＰＲ）＋微效（ＭＲ）为２８例（４４．４５％）；２０例ＣＥＡ增高，治疗后有１４例减低；１０例ＡＦＰ增高者，治疗后有９例减低；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８Ｔ淋巴细胞绝对值在ＣＩＫ治疗后增加４５％以上；治疗后６３例中有５１例患者食欲增加，３２例患者睡眠和体力改善，１８例患者有１３例疼痛减轻。仅３例在回输后出现低热，经对症处理后２４ｈ降至正常。ＣＩＫ过继免疫疗法能明显提高癌症患者免疫功能，改善临床症状，延长生存期，且无毒副作用。７ＤＣ和ＣＩＫ的输注途径未成熟ＤＣ在外周组织捕获抗原后，需经引流淋巴管迁移至局部淋巴结，在淋巴结Ｔ细胞区与初始型Ｔ细胞接触并活化初始型Ｔ细胞，因此，ＤＣ的输注途径可能决定了细胞免疫能否发生及发生的强弱。动物实验表明，皮下和皮内注射ＤＣ比静脉注射更易诱导细胞毒性Ｔ淋巴细胞反应。Ｍｏｒｓｅ等用铟标记的ＤＣ分别经静脉、皮下和皮内途径注入患者体内，发现静脉注入的ＤＣ主要分布在肝脏、脾和骨髓，而皮下和皮内注射的ＤＣ快速转移至局部淋巴结。目前认为静脉注射有利予ＤＣ在体内的分布，但也可能大部分被肝脏清除和抑制，皮下淋巴结区域注射有利于ＤＣ和Ｔ细胞的接触。岳欣等研究不同输注途径对ＣＩＫ治疗后的体内分布的影响，动物实验表明ＣＩＫ输人体内后，迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官，其中肝、脾、肾的分布浓度最高。研究表明，ＣＩＫ体内分布万方数据・ｔ９７・的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗，而血管输入途径可能更适于血供丰富器官肿瘤的治疗，而体腔输入途径也许更适合于体腔内恶性渗液或局限病灶的治疗。８展望ＤＣ这种特殊的免疫细胞，不仅有专职抗原提呈作用，更是一种天然的免疫佐剂，具有重要的免疫调节功能。因此，在抗肿瘤的过程中发挥着强大的作用。目前，应用ＤＣ治疗肿瘤已取得了初步成果，但仍有许多问题有待研究，如ＤＣ使用的剂量及时间，基因修饰ＤＣ常受到可感染ＤＣ的数量、组织选择性和应用安全性的限制，虽然大多数研究表明应用ＤＣ安全、无副作用，但是有人发现Ｄｅ疫苗诱导抗肿瘤效应的同时也诱发了严重的自身免疫性疾病，相信随着研究进一步深入，ＤＣ必将成为肿瘤免疫治疗的一种新的有效方法。ＣＩＫ杀瘤抑瘤作用不仅在实验室得以证实，而且已经逐步应用临床，成为新一代肿瘤过继免疫治疗的主力军。有着广阔的研究前景，但还存在很多亟待解决的问题，需要更加深入的探索和多方面研究。在临床治疗上，体内外环境对ＣＩＫ影响的差异及同步注射ＩＬ一２等细胞因子对其疗效是否有提高等问题尚存在争议，对于不同临床阶段的肿瘤患者，自体ＣＩＫ的体外增殖、杀瘤特点及体内治疗作用尚需进一步研究。此外，建立ＣＩＫ过继免疫治疗的统一方案、ＣＩＫ的最佳培养途径、ＣＩＫ的应用剂量及回输后抗体抗肿瘤免疫功能维持时间等方面尚待继续深入探讨。相信ＣＩＫ和ＤＣ细胞免疫治疗联合化疗及放疗，将有助于减少恶性肿瘤的转移与复发，进一步提高临床疗效，对肿瘤的治愈带来新的希望。