肾母细胞瘤中cyclinDl和P16蛋白的表达研究

肾母细胞瘤中cyclinDl和P16蛋白的表达研究

[摘要]目的：探讨cyclinDl和P16蛋白在肾母细胞瘤发生发展中的作用及其与临床病理特征的关系。方法：应用免疫组化法测定36例肾母细胞瘤和8例正常肾脏组织中cyclinDl和P16蛋白的表达。结果：(1)肾母细胞瘤中cyclinDl及P16蛋白的表达阳性率分别为55.56％(20／36)、61.11％(22／36)；肾母细胞瘤组cyclinDl蛋白表达与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，瘤组织P16蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)肾母细胞瘤的组织分型、临床分期和有无淋巴结转移对cyclinDl和P16蛋白表达的影响无显著性差异(P>0.05)。(3)cyclinDl蛋白与P16蛋白的表达无明显相关性(P>0.05)。结论：(1)cyclinDl蛋白的高表达与肾母细胞瘤的发生密切相关。(2)cyclinDl和P16蛋白的浆型表达与该肿瘤的发生密切相关。

[关键词]肾母细胞瘤；cyclinDl蛋白；P16蛋白；免疫组织化学

肾母细胞瘤是小儿腹部最常见的恶性实体肿瘤之一，目前其发生的机制还不清楚，在临床上难以有效防治及判断预后。近年来大量研究证实细胞周期调控因子表达异常与许多肿瘤的发生密切相关，但关于肾母细胞瘤的鲜有文献报道。本研究利用免疫组化方法检测细胞周期相关调控因子cyclinDl和P16在肾母细胞瘤中的表达，并探讨这些蛋白表达与该肿瘤临床病理特征之间的关系。

1. 材料与方法

1.1 病例选择

病例取自本院1991年1月至2008年6月间外科手术切除、经病理确诊的肾母细胞瘤共36例存档蜡块，男22例，女14例，手术时患儿年龄20d～5岁，左侧18例，右侧18例。按NWTS-3(National WilmsTumor Study)分期标准，Ⅰ期22例，Ⅱ期9例，Ⅲ期5例，Ⅳ期0例。组织学类型：预后良好型(FH)包括上皮型10例，混合型9例，间质型9例，胚芽型6例；预后不良型(UH)又称间变型2例。有淋巴结转移3例，无淋巴结转移33例。另取小儿外科手术切除的外伤性正常肾组织8例。标本全部进行免疫组化染色。

1.2 免疫组化染色方法

1.2.1 主要试剂

单克隆抗体，兔抗人cyclinDl蛋白、鼠抗人P16蛋白及其二步法试剂盒，均购自上海长岛生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化染色方法 采用免疫组化二步法，严格按照试剂盒操作说明进行操作。

1.2.3对照 采用阳性组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.4结果判定 阳性信号为棕褐色或棕黄色颗粒，对于阳性信号的定位以细胞质表达和(或)细胞核表达进行统计，免疫组化染色结果根据文献[3]报道的半定量标准进行评价。

1.3 统计学处理

应用SPSS13.0统计软件包，采用x2检验、Fisher确切概率检验，双侧a=0.05为检验水准。

2. 结果

2.1 cyclinDl蛋白

正常肾脏组织不表达cyclinDl蛋白(0／8)，肾母细胞瘤组织的阳性表达率为55.56％(20／36)；不同组织分型、临床分期和有无淋巴结转移的肾母细胞瘤标本中cyclinDl蛋白表达情况见表1。阳性信号定位于细胞核(图1)。正常组与肾母细胞瘤组间表达差异有显著性(2=8.148、P＜0.05)。肾母细胞瘤的组织分型、临床分期和有无淋巴结转移对cyclinDl蛋白表达的影响无显著性差异。

2.2 P16蛋白

正常肾脏组织P16蛋白的表达阳性率为87.5％(7／8)，阳性信号定位于细胞质；肾母细胞瘤组织P16蛋白的表达阳性率为61.11％(22／36)。不同组织分型、临床分期和有无淋巴结转移的肾母细胞瘤标本中P16蛋白表达情况见表1，阳性信号大部分呈现细胞核、细胞质共同着色(图2)。正常组与肾母细胞瘤组间表达差异无显著性(x2=1.024、P>0.05)。肾母细胞瘤的组织分型、临床分期和有无淋巴结转移对P16蛋白表达的影响无显著性差异。

肾母细胞瘤组织中cyclinDl与P16蛋白表达的比较见表2，经卡方检验，两者之间无明显相关性[r(s)=-0.025，P>0.05]。

3. 讨论

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期素(cyclins)促进细胞周期进程，而细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKIs)则抑制细胞周期进程。cyclinDl在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，在多种肿瘤组织中均过表达。cyclinDl蛋白

在肾母细胞瘤中的研究鲜有报道。本研究发现肾母细胞瘤中cyclinDl蛋白的表达较高，与正常组比较差异有显著性，表明cyclinDl蛋白在肾母细胞瘤的发生过程中起重要作用；但蛋白表达与肿瘤组织分型、分期及有无淋巴结转移均无明显相关性，与宋兰云等的研究结果基本一致。

P16蛋白作为INK4家族中一员，在肿瘤中的抑癌作用受到广大学者的关注。它与cyclinDl竞争细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)的结合，抑制CDK4活性，使细胞不能从G1期进入S期，从而阻止细胞增生，直接参与细胞周期调控。P16蛋白在多种肿瘤中除宫颈癌外表达较低或缺失，并导致肿瘤细胞无限制生长。Arcellana-Panlilio等研究认为，P16的缺失率随着肾母细胞瘤的分期升高而增加。Natrajan等研究发现P16蛋白在大部分肾母细胞瘤中呈阴性表达，其中38／236(16.1％)的非间变型肾母细胞瘤，4／9(44.4％)的间变型肾母细胞瘤表现为细胞核着色。我们研究发现，P16蛋白在肾母细胞瘤组织中表达较高，低于正常组，但与正常组比较差异无统计学意义，与肿瘤组织分型、分期及有无淋巴结转移均无明显相关性。我们推测肿瘤发生过程中机体可能发生本能的防御反应，为了抑制肿瘤的进程，反应性地引起肿瘤抑制基因表达的上调，若没有达到一定的程度即不能抑制肿瘤的发生，从而出现即使有较高水平表达也不能抑制肿瘤的发生，这可以部分解释本研究的实验结果。

关于蛋白表达定位的问题，诸多文献中以单一的细胞核或细胞质表达计算。本研究中无论细胞核或细胞质表达均计为阳性表达，同时还结合了阳性细胞数与染色强度进行结果评判，使实验结果更具有科学性。理论上讲P16为核蛋白，在胞质核蛋白体中合成后需转入胞核才能进一步发挥其调节细胞周期的功能。本研究发现P16蛋白在正常肾脏组织中呈现细胞质表达，而在瘤组织中核与质共同着色。该蛋白抑制肿瘤作用表达方式的改变未见于文献报道，关于其细胞质表达方式的作用相关分子或细胞信号机制有待进一步研究。在瘤组织中的核质表达及表达阳性率较高尚不能有效发挥抑癌的作用，我们认为肿瘤的进程是由复杂的网络系统调控的，是正负性因子及多基因综合作用的结果，由P16蛋白单独主导的可能性较小。

cyclinDl与P16分别作为细胞周期正负性调控因子的代表，在肿瘤组织中的表达形式理应表现为相互排斥，但本研究中未发现两者在肾母细胞瘤中具有任何相关性。据此我们推测，多种细胞周期正负性因子综合作用才可能表现为显著的相互排斥，对于单一的因子可能在大样本及相匹配的条件下才能与理论结果相吻合。