目臣覆 螭 ＿ — ＿ — ｜ 嘤 ｃ＾ ｍ 动物布鲁氏菌病实验室诊断与检测技术进展 程建国 张富荣 李小东。陈有为 孙建强 张卫东 （１．巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古临河０１５０００； ２．巴彦淖尔市职业技术学校，内蒙古临河０１５０００； ３．乌拉特后旗乌盖苏木畜牧兽医工作站，内蒙古乌盖４．杭锦后旗动物疫病预防控制中心，内蒙古陕坝０１５０００； ０１５０００） 摘 要：实验室诊断与检测对防治动物布鲁氏菌病 氏菌病诊断和检疫主要手段，其方法众多，各有所长。因此，在 （ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）至关重要，其不仅可早期发现传染源和隐性感 实际工作中，最后选用一种以上的方法相互配合，以确保检验结 染动物，而且可检测动物通过疫苗免疫后产生的抗体水平，为合 果准确无误。 理制定免疫程序提供科学依据。实验室诊断与检测动物布鲁氏菌 病常规方法包括：一般实验室检查、免疫血清学试验和病原学检 查：高新生物技术包括：应用分子生物学技术检测及荧光偏振试 验（ＦＰＡ）。目前，我国对该病诊断的国家标准主要是依据细菌 学和血清学检测结果来确定。其中免疫血清学试验是我国最常用 的诊断与检测方法，该方法不仅可用于动物布鲁氏菌病的诊断与 检测，而且还用于人感染布鲁氏菌病的诊断与检测。但是，这种 诊断与检测方法在我国已经使用半个多世纪，并且存在着许多弊 端，诸如：非特异性反应、假阳性、前带现象或动物自身免疫抑 制等，因此还远不能满足对动物布鲁氏菌病的防控需求。探索动 物布鲁氏菌病的实验室诊断与检测新技术以及高新分子生物学技 术的研究进展，对于早期开展动物布鲁氏菌病的分子流行病学调 查、早期确诊和防控均具有重要意义。 关键词：布鲁氏菌病；实验室；诊断；检测 动物布鲁氏菌病（ｂｒｕｃｅｌ｜ｏｓｉｓ）简称布病，是由布鲁氏菌引 起的人、畜共患传染病，其特征是生殖器官和胎膜发炎，临床表 现为低热、关节肿胀、疼痛；可弓Ｉ起母畜流产、不孕；引起公畜 睾丸肿胀、繁殖力下降；布鲁氏菌还可驻留于其他组织器官，引 起不同程度的局部病灶等损害。人感染布鲁氏菌后，临床表现多 样．有急性、亚急性和慢性之分。急性和亚急性可产生菌血症， 主要表现为体温呈波型热或长期低热、寒战、盗汗、全身不适、 关节炎、神经痛、肝脾肿大以及睾丸炎、附睾炎等，孕妇可能发 生流产，有时可能累及多个器官，呈现不同程度临床体征；慢性 多侵犯脊柱和大关节，通常无菌血症，但感染可持续多年。该病 广泛存在于世界各地。我国目前在人、动物间仍有发生；而在我 区，部分盟市的人间感染布鲁氏菌病则呈现上升趋势。按照《动 物防疫法》，我国将该病列为二类传染病，自治区已将该病列为 重大动物疫病，加以防控。 １ 一般实验室检查 白细胞正常或偏低，淋巴细胞相对增多，有时可见异常淋巴 细胞，少数病例血小板减少；细菌侵入机体后，可形成菌血症。 急性期可出现血沉加快。 ２免疫学检测 目前，有诸多方法，归纳起来，不外乎血清中布鲁氏菌抗体 检查和感染病料中是否存在布鲁氏菌病原体的检查两大类。动物 感染布鲁氏菌一般于７～１５ｄ血清中可出现抗体（最早出现的抗体 是ＩｇＭ，然后是ＩｇＧ和其他抗体）。检测血清中的抗体是动物布鲁 ２．１凝集试验 属于传统的试验方法，包括玻板凝集试验、虎红平板凝集试 验（ＲＢＰＴ）、乳汁环状试验、缓冲平板凝集试验（ＢＰＡＴ）、试 管凝集试验（ＳＡＴ）。 ＳＡＴ的优点是操作简便，判定容易，具有较高的诊断价值， 一般不单独使用，常常与其他测试方法组合使用。如检出阳性 后，再用补体结合试验进行实验室最后确诊。ＲＢＰＴ或ＢＰＡＴ多用 于现场和大群初筛。 ２．１．１试管凝集试验与玻板凝集试验。牛、马、骆驼等大动物血 清凝集价（或玻板凝集试验中相当的凝集价）达到１：ｌ００时，判定 为阳性，１：５０为可疑；羊猪、狗等血清凝集价：１：５０为阳性，１：２５ 为可疑。为了提高检出率，对羊血清可用１２％的高渗盐水作为稀 释液。可疑病畜３—４周后应采血重检，如仍为可疑，牛、羊可按 阳性处理，猪、马则须视具体情况而定，若畜群以往既无本病存 在，目前又无临床病例，且血检无一例阳性出现，则可判定为阴 性。人血清凝集价１：１００为阳性。 ２．１．２ 虎红平板凝集试验。取受检血清和虎红平板抗原各 ０．０３ｍｌ，滴加于玻片上，混匀，４—１０ｍｉｎ内发生凝集者可判为阳 性。虎红平板抗原是用虎红使抗原细菌染色成酸性（ｐＨ３．６５左 右）的缓冲平板抗原，可抑制引起非特异性反应的ＩｇＭ和增强特 异性抗体ＩｇＧ的活性，其反应敏感、稳定，特异性优于试管凝集试 验，并且，特异性抗体ＩｇＧ一旦消失，该试验即变为阴性，因而， 其试验结果与布鲁氏菌病转归有着明显的一致性。 ２．１．３乳汁环状试验。该试验常用于检测动物新鲜乳汁，操作简 便，准确性较高，被广泛用于牛、羊布鲁氏菌病的诊断。 上述凝集反应，可出现由非特异性免疫球蛋白（例如因免 疫接种而产生的ＩｇＭ抗体）弓Ｉ起非特异性反应；另外，某些慢性 病例产生不完全抗体，也不能呈现阳性反应，故应加以区别， 以免误判。对于疑难的病例，还可选择抗免疫球蛋白试验、巯 基乙醇试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验等作为辅助诊 断方法。 ２．２抗人免疫球蛋白试验（Ｃｏｏｍｂ’ｓ） 机体受抗原刺激后可以产生“完全抗体”与“不完全抗 体”。不完全抗体虽可与相应抗原结合，但不出现可见的凝集反 应。若将含有不完全抗体的人或动物血清球蛋白作为抗原，注射 于另一种动物（常用家兔）制成抗此球蛋白（抗ＩｇＧ、ＩｇＡ及ＩｇＭ） 的抗体。再将此抗球蛋白抗体加入抗原与不完全抗体复合物中， 即可出现可见的凝集反应。Ｃｏｏｍｂ’ｓ滴度１：４００＋＋及以上为布病诊 ｌ 。觋・ｃ０ｍ § 断标准。 ２．３补体结合试验（ＣＦＴ） 度高于普通ＰＣＲ、特异性强，能在同一反应管中同时检测多种病 原体，准确性更高。 ＣＦＴ至今仍是布鲁氏菌病的重要诊断方法，是国际贸易指定 ４．２ ＡＭＯＳ—ＰＣＲ（ａｂｏｒｔｕｓ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ｏｖｉｓ ｓｕｉｓ－ＰＣＲ） 用于牛、羊布鲁氏菌病实验室确诊的试验方法。但ＫｌａｕｓＮｉｅｌｓｅｎ认 ＡＭＯＳ—ＰＣＲ是根据布鲁氏菌不同种的ＩＳ７１ １序列位置的不同设 为ＣＦＴ结论具有主观性，而且不能鉴别人工免疫和自然感染，实 计引物，即一个引物瞄定在ＩＳ７１１上，其他不同的引物分别选在与 验条件复杂苛刻，不便向基层推广，不宜在现场进行。Ｓｅａｒｓｏｎ提 ＩＳ７１ ｌ插入序列邻近的单染色体ＤＮＡ上，以代表种的特异性，通过 出改良的微量Ｃ兀怯，相比于ＣＦＴ具有更高的敏感性和特异性，且 扩增片段的大小来鉴别。Ｂｒｉｃｋｅｒ等用ＡＭＯＳ—ＰＣＲ方法对牛布鲁氏 价廉、快速，适于自动化及易于标准化。一般发病３周后出现ＩｇＧ 菌、猪流产布鲁氏菌及绵羊布鲁氏菌的不同变种在２４ｈ内即可进行 抗体，由于此抗体能维持较长时间，故诊断慢性布病意义较大。 该试验特异性高，滴度１：１０＋＋及以上可判为阳性。 ２．４变态反应检查 布病为第１ｖ型传染性变态反应，一般在感染后的２０—２５ｄ出 现，故此法不易作早期诊断，主要用于绵羊、山羊、猪的慢性布 病检测。其方法是将布鲁氏菌水解素０．２ｍｌ注射于羊尾根皱皱襞部 或猪耳根部皮内，２４ｈ及４８ｄ各判定一次，若注射部位发生红肿， 即可判为阳性。此法对慢性病例的检出率较高，而且注射鲁氏菌 水解素后，无抗体产生，不妨碍以后的血清学检查。 ２．５酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） 用ＥＬＩＳＡ检测标本中的抗原或抗体是上世纪７０年代初应用的 一项技术。它较ＳＡＴ和ＣＡＴ敏感并且特异性高，操作方便，可用 于确证和筛选试验。目前牛种和猪种布鲁氏菌的ＥＬＩＳＡ试验是国 际贸易中的指定试验。猪布鲁氏杆菌和绵羊布鲁氏菌已有成熟的 ＥＬＩＳＡ诊断技术ＥＬＩＳＡ分为间接ＥＬＩＳＡ和竞争ＥＬＩＳＡ两类。大部分 间接ＥＬＩＳＡ使用纯化的光滑型ＬＰＳ作为诊断抗原，通常检测的是 ＩｇＧ类免疫球蛋白，敏感性极高，但同时假阳性也较高。这类假阳 性通常是由小肠结肠耶尔森菌０９的类属抗原成分所致，可由竞争 ＥＬＩＳＡ所排除。 ３病原学检查 从患畜血液、骨髓、关节液、脑脊液、尿液及淋巴等组织 中可分离培养出布鲁氏菌，该菌革兰氏染色阴性，呈球形、球杆 形或短杆形，新分离者趋向球形，多单在，很少成双、短链或 小堆状排列。不形成芽孢和荚膜，偶尔有类似荚膜样结构，无鞭 毛不运动。急性期患畜血液、骨髓阳性率可达８０％，关节液可达 ５０％，慢性患畜阳性率较低。布鲁氏菌属共有６个生物种、１９个生 物型。我国流行的主要是羊布鲁氏菌病，其次为牛布鲁菌病。 布鲁氏菌营养要求高，在专用培养基上４～７ｄ或更长时间生 长。菌落形态湿润、圆形、表面光滑、无色透明；菌苔无色透 明、湿润，用布鲁氏菌诊断血清与培养物做玻片和试管凝集试 验，呈阳性反应。 ４分子生物学技术的应用 ＰＣＲ（聚合酶链反应）方法可在物种和生物型水平上进行布 鲁氏菌鉴定。这些技术要求最小的生物安全，并能在非常短的时 间内提供结果。 ４．１ 多重聚合酶链反应（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ） Ｓｒｅｅｖａｔｓａｎ等运用多重ＰＣＲ技术检测牛布鲁氏菌和牛分枝 杆菌。该实验采用两个种特异性靶序列：①流产布鲁氏菌的 ＢＣＳＰ３１Ｋ基因的一段序列；②牛分枝杆菌ｈｓｐ６５基因的一段重复序 列，扩增后采用一种固相探测检测扩增产物。杜听颖等针对布鲁 氏菌外膜蛋白３１ｋＤ、２２ｋＤ和２ａ基因，设计引物进行多重ＰＣＲ，经 过实验优化，确定了多重ＰＣＲ中引物的最适浓度。多重ＰＣＲ灵敏 分型，并能区分疫苗株和野毒株，从而为早期诊断和预防提供了 科学依据。 ４．３巢式ＰＣＲ 唐莉娟等根据ＧｅｎＢａｎｋ中布鲁氏菌的ＤＮＡ序列，针对布鲁氏 菌膜蛋白Ｏｍｐ２２基因设计引物进行巢式ＰＣＲ，模板稀释倍数为 １０１０，可扩增到最终目的条带，从而增加了检测的灵敏性和可靠 性。Ｋｉｍ等则将多重ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ相结合，特异性更强，敏感度 更高。 ４．４实时荧光定量ＰＣＲ Ｒｅｄｋａｒ等研究设计了实时荧光定量ＰＣＲ方法，特异性检测分 析了流产布鲁氏菌、羊型布鲁氏菌和猪流产布鲁氏菌。Ｂｏｕｎａａｄｊａ 等也用该法鉴定布鲁氏菌，同时与普通ＰＣＲ进行比较，本法灵敏 度高，可达到普通ＰＣＲ的５０～５００倍，不与其他非布鲁氏菌发生 交叉反应，但可与普通ＰＣＲ用相同的引物，操作简单快速，易推 广，不易产生污染，是Ｅｔ前检测动物布鲁氏菌病效果较好并且可 重复进行检测的重要方法。 ４．５脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ） ＰＦＧＥ是一种分离大分子ＤＮＡ的方法，可以用来分离大小从 ２５ｋｂ到１０Ｍｂ的ＤＮＡ分子。在普通的凝胶电泳中，大的ＤＮＡ分子移 动迅速接近，很难分离形成足以区分的条带，在ＰＦＧＥ中，电场不 断的转换方向，相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动 方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难，因此，小分子向前 移动的速度比大分子快。 ＰＦＧＥ技术特点就是用来研究细菌的分子流行病学特点，能够 对全基因组进行分析，最终分析的ＤＮＡ超过９０％，可以从整个基 因组的角度考虑菌株间的关系。用稀有位点的限制性内切酶进行 酶切可以获得菌种某亚种特有的电泳图谱，是ＰＦＧＥ技术的显著优 势。ＰＦＧＥ技术分型能力强，重复性好、分辨率高、结果稳定并易 于标准化。 ５荧光偏振试验（ＦＰＡ） ＦＰＡ是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小成 反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。ＦＰＡ是利用 荧光素经单一波长（蓝光）的偏振光照射后，能吸收光能并发射 出相应的偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关。 Ｇａｌｌ Ｄ等用ＦＰＡ检测牛种布鲁氏菌，并与其他血清学检测方法进行 比较，认为ＦＰＡ是检测牛布鲁氏菌最稳定的血清学方法。通过双 盲实验证实ＦＰＡ还可以区别牛种布鲁氏菌感染和疫苗株Ｓ１９免疫接 种。ＦＰＡ省去了洗涤步骤，减少了馥郁，大量节省了检测时间， 降低了检验费用，而且有较高的敏感度和特异性，是最有吸引力 的牛种布鲁氏菌血清抗体检测方法。 综上所述，虽然布鲁氏菌检测技术已有了很大的发展，但 是还没有一种单一的方法能适应任何情况下进行快速、准确检测 ２７ 匹墨 谳镯具 ｌ ｌ 囊 ｌ｜ ｆｏｒ ｂｏｖｉｎｅ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ａｕｓｔ Ｖｅｔ Ｊ，１９７６， （５２）：１３６－１４０． ｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ［７】 Ｓｅａｒｓｏｎ ＪＥ．Ｓｅｎｓｉ的布病诊断项目。布病的各种诊断技术具有不同的适用范围，而 且各自都存在着一些缺点和局限性，因而不能相互取代。国家法 定标准的检测手段仍以细菌学和血清学诊断为主，血清学作为动 ｒａｍｓ［Ｊ］．Ａｕｓｔ Ｖｅｔ Ｊ，１９８２，５８（１）：５—７． ｓｅｎ Ｋ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｂｙ ｓｅｒｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ［８ ８］ＮｉｅｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，９０（１—４）：４７—４５９． ｅｅｖａｔｓａｎ Ｓ，Ｂｏｏｋｏｕｔ ＪＢ，Ｒｉｎｇｐｉｓ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ａ ｍｕｉｔｉｐｌｅｘ ａｐｐｒｏａｃｈ ［９］ Ｓｒｔｏ ｍｏｌｅｅｕｌａｒｄｅｔｅｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ａｎｄ／ｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｅｖｉｓ 物布鲁氏菌病诊断的常规方法，但不足之处是检测依赖于体内的 抗体水平，与其他抗体存在交叉反应而导致假阳性等；优点是快 速、简便、费用低。以ＰＣＲ为代表的分子生物技术不仅用于布鲁 氏菌菌种的鉴定，还能反映基因间存在的差异。实践中通常需要 根据检测目的来拟定检测策略，往往需要几种方法相互配合，才 高的方法进行初筛，以防漏检；以特异性高的方法进行确诊，以 作为初筛，再以试管凝集试验作为确诊，或以间接ＥＬＩＳＡ作为初 ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，３８（７）：２６０２—２６１０． 能取得较为科学合理的检测结果。选择原则通常是简便、敏感性 ［１０】 杜昕颖，陈泽良，王玉飞，等．多重ＰＣＲ特意检测布鲁氏菌方法 的建立［Ｊｌ＿解放军预防医学杂志，２００８，１０，２６（５）：３４１—３４３． 剔除非特异性反应、前带现象和假阳性。如首先以虎红凝集试验 ［１１］ 杨海荣，关平原，范伟兴．ＡＭＯＳ ＰＣＲ在布鲁氏菌种型鉴定中应 用的研究［Ｊ】＿中国动物检疫，２００７，２４（１Ｏ）：２５—２８． ｉｃｋｅｒ ＢＪ，Ｈｍｌｉｎｇ ＳＭ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｕｅｅｌｌａ ａｂｏ￣ｕｓ ｂｙ．１，２ 筛，以竞争ＥＬＩＳＡ作为确诊。未来随着检测技术的不断发展和完 ［１２］ Ｂｒ善，ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、ＰＦＧＥ、和ＦＰＡ等高新技术方法，因其敏感性 高、特异性强、检测时间短，即将成为动物布鲁氏菌病检测的重 断和预防中，使检测更加快速、简便和准确，最终为彻底控制和 消灭动物布鲁氏菌病发挥更加积极的作用。 参考文献 ［１］陆承平．兽医微生物学（第３版）［Ｍ］．北京．中国农业出版社， ２００１：９７－１０２，２６５—２７０． ｎｄ Ｂｒａｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ， Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ， ａｎｄ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ ｂｖ．１ ｂｙ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，３２（１ １）：２６６０－２６６６． 要手段。未来还将会有更先进的技术应用到动物布鲁氏菌病的诊 ［１３］ 唐莉娟，陈创夫，王志远，等．畜产品中布鲁氏菌巢氏ＰＣＲ快速 诊断方法研究［Ｊ】．上海畜牧兽医通讯，２００８，（４）：３９—４１． Ｓｕｚｕｌｉ Ｈ， ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ ａｎｄ ［１４］ Ｋｉｍ Ｓ，Ｌｅｅ ＤＳ，Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｓｅｍｅｎ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２００６，６８（６）：６１５—６１８． ［１５】 Ｒｅｄｋａｒ Ｒ，ｒｏｓｅ Ｓ，Ｂｒｉｃｋｅｒ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ［２］蔡宝祥，陈溥言，沈正达．家畜传染病学（第４版）［Ｍ］．北京：中 国农业出版社。２００１：７６—８１． Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏ￣ｕｓ，Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，２００１。１５（１）：４３—５２． 【３】刘倩宏，吴清民，刘红卿，等．布鲁氏菌外膜蛋白ＯＭＰ２５的原核 【１６１ Ｂｏｕｎａａｄｊａ Ｌ，Ａｌｂｅａ Ｄ，Ｃｈ ｅ ｎａｉｓ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ 表达与鉴定【Ｊ】＿中国兽医杂志，２００８，４４（８）：１８—１９． ［４】Ｍａｔｙａｓ Ｚ，Ｆｕｊｉｋｕｒａ Ｔ．Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ａｓ ａ ｗｏｒｌｄ ｐｒｏｂｌｅｍ［Ｊ］．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．：Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆＩＳ７１１，ｂｃｓｐ３１ ａｎｄ ｐｅｒｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，１３７（１—２）：１５６—１６４． Ｓｔａｎｄ，１９８４，５６（７）：３－２０． 【５］Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｋ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ ｂｙ ｓｅｒｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ［１７］ Ｖｉｑｌｉｏｃｃｏ ＡＭ，Ｓｉｌｖａ Ｐａｕｌｏ ＰＳ，Ｍｅｓｔｒｅ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，５４ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，９０（１－４）：４４７—４５９． ［６】Ｐｌａｃｋｅｔｔ Ｐ，Ｃｏｔｔｅｗ ＧＳ，Ｂｅｓｓ ＳＪ．Ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍｏｌｉｓｉｓ ｔｅｓｔ（ＩＨＬＴ） （３—４）：３５７—３６８． （上接第６８页） 趋势来看，免疫效果水平较稳定，都保持在９０％以上；从规模养 禽流感发生的能力，抗体水平越高，发生Ｈ５型禽流感的风险 越 禽场和散养禽场Ｈ５型禽流感抗体合格率变化趋势比较来看，规模 低，但要真正将发生动物疫病的风险降到最低，还必须切断病毒 场略高于散养户，表明规模场Ｈ５型禽流感免疫工作做得比散养户 的传染源，包括带毒的畜禽、野禽和环境。目前，禽流感病毒检 要好。 测方法主要是ＲＴ—ＰＣＲ检测和荧光ＲＴ—ＰＣＲ定量检测，本试验采用 （２）由于Ｈ５型禽流感传染源主要为患禽流感或携带禽流感 ＲＴ—ＰＣＲ检测，通过检测，未发现病原学阳性样品，表明无锡市 病毒的家禽，另外猪也可成为传染源，因此，本试验增加了对靠 养禽场、野鸟栖息地Ｈ５型禽流感病毒带毒现象较少，一定程度上 近规模养鸡场附近的养猪场进行猪非免疫抗体水平检测，通过检 确保了不发生Ｈ５型高致病禽流感疫情。 测，掌握猪感染情况和对家禽发生Ｈ５型高致病情流感威胁情况。 （４）通过此次定点、持续监测调查，可以进一步探索动物疫 通过对猪进行Ｈ５型禽流感非免疫抗体水平检测，阳性率为０％， 病监测机制，全面掌握主要畜禽养殖地区的疫情发展势态，第一 说明禽流感病毒暂时未出现不同畜种问的迁移，猪传播禽流感病 时间发现疫病隐患，采取有效措施消除潜风险，充分发挥实验室 毒的可能性较小。 对重大动物疫病预警预报科学支撑的作用。 （３）Ｈ５型禽流感免疫抗体水平检测旨在评价禽类抵抗Ｈ５型