第ｌ８卷第１期 ２００７年３月 化学 研究 Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．１ Ｍａｔ．２００７ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ２，６－双（３－甲基－１Ｈ－吡唑基）４・氨基吡啶的合成与表征 李珍 ，钮倩倩 ，张德文ｈ （１．长春工业大学生物工程学院，吉林长春１３００１２；２．东北师范大学化学学院．吉林长春１３００２４） 摘要：以２，６－二溴吡啶为起始原料，经过氧化、硝化、还原、亲核取代等四步合成了新型时间分辨荧光免疫分析 双功能螯合剂中间体２，６－双（３一甲基一１Ｈ一吡唑基）－４一氨基吡啶．化合物结构通过ＤＳＣ，ＩＲ，气质联用色谱（Ｇｃ． Ｍｓ），’Ｈ ＮＭＲ和元素分析等确证，对合成条件进行了探讨． 关键词：时间分辨荧光；免疫分析；２，６一二溴４．氨基吡啶；螯合剂；中间体 中图分类号：０ ６２６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—１０１１（２００７）Ｏｌ一００４３—０３ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ２，６－Ｂｉｓ（３－ｍｅｔｈｙｌ－１ Ｈ－ ｐｙｒａｚｏｌ－１一ｙ１）－４－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ＬＩ Ｚｈｅｎ’ＮＩＵ Ｑｉａｎ—ｑｉａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｄｅ—ｗｅｎ’ ，ｒ１．Ｓｈｏｏｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆＴｅｃｈｎｏｌｏｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００１２，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｅａｓｔｈ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｅｒｓｖｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １ ３００２４，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉａ）ｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｅｗ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｅｌａｔｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｏｆ ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，２，６．ｂｉｓ （３－ｍｅｔｈｙｌ一１ Ｈ—ｐｙｒａｚｏｌ一１一ｙ１）－４一ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ２，６－ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｂｙ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ｎｉ— ｔｒａｔｉｏｎ，ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ，ＩＲ，。Ｈ ＮＭＲ，ＧＣ—ＭＳ ａｎｄ ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；２，６－ｄｉｂｒｏｍｏ－４一ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；ｃｈｅｌａｔｅ；ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ— ａｔｅ 时间分辨荧光免疫分析（ＴＲＦＩＡ）是２０世纪８０年代初发展起来的一项极有价值的免疫分析技术¨卫］． 迄今，时间分辨荧光免疫分析已发展到五种系统，即解离增强荧光免疫分析系统（ＤＥＬＦＩＡ） 】、直接固相荧 光免疫分析系统（ＤＳＬＦＩＡ） 、均相时间分辨免疫分析系统（ＬＡＮＣＥ）Ｅ６］、酶放大荧光检测系统（ＥＡＬＬ） 和 多标记分析技术系统，它们各有不同的特点和应用．其中ＤＥＬＦＩＡ系统已实现了商品化，而ＬＡＮＣＥ系统以 联吡啶类穴状螯合物（ｔ ｉｐｙｒｉｄｉｎｅｒｙｐｔａｔｅ ＴＢＰ）与Ｅｕ¨离子等希土离子螯合后实现与蛋白质连接，可直接 进行固相和均相荧光测定，且操作简便，具有生物技术研究和应用前景．本实验设计的时间分辨荧光免疫分 析螫合剂中间体，２，６一双（３一甲基一１Ｈ一吡唑基）－４一氨基吡啶，可用于合成ＤＳＬＦＩＡ系统与ＬＡＮＣＥ系统螯合剂， 该中间体的合成在国内外未见报道． １ 实验部分 １．１试剂与仪器 ２，６一二溴吡啶（工业品，北京维达化工有限公司），还原铁粉（分析纯，天津市化学试剂三厂），金属钾（分 析纯，成都科龙化工试剂厂），三氟乙酸（分析纯，济南市美华实业总公司），３一甲基吡唑（分析纯，Ａｌｄｒｉｃｈ公 司），二甘醇二甲基醚（ｄｉｇｌｙｍｅ）（分析纯，安徽立兴化工有限公司），３０％过氧化氢、发烟硝酸、浓硫酸、冰醋 收稿日期：２００６一ｌ１—０６． 作者简介：李珍（１９７５一），男，硕士，主要从事有机螯合剂合成研究， 通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｏｄｅｍｌｚｈ＠１２６．ｃｏｒｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com
化学研究 ２００７拄 酸、氯仿、甲醇、正己烷、无水碳酸钠（均为分析纯，北京化工厂），乙醚（分析纯，天津市天泰精细化学品有限 公司）． ＦＴＳ １３５傅立叶红外光谱仪（美国ＢＩＤ—ＲＡＤ公司），Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ａｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍｅ（德国ＧｍｂＨ Ｖ ｏＥＬ）， ＰＥＲＫＩＮ．ＥＬＭＥＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ，气一质联用仪（美国Ａｇｉｌｅｎｔ／／６８９０Ｎ－５９７５），ＡＶ４００核磁共振仪（瑞士 Ｂｒｕｅｋｅｒ公司）． １．２合成方法 标题化合物的合成路线如图１所示． 意 昂 ２ ３ Ｋ ＣＨ ４ ＣＨ 图１ 标题化合物的合成路线 Ｆｉｇ．１ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｏｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｔｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ １．２．１ Ｎ一氧化－２，６一二溴吡啶（ＤＢＯＰ）（１）的合成 参照文献［８］合成，将分离方法改为直接萃取法．在５００ ｍＬ三颈瓶中加入３０．０ ｇ（Ｏ．１２５ ｍｏ１）２，６一二溴 吡啶，１９０ ｍＬ三氟乙酸，４０ ｍＬ ３０％（０．３６５ ｍｏ１）的过氧化氢，４２℃搅拌反应３ ｈ，冷却至室温，倒入３ ０００ ｍＬ 蒸馏水中，冷却至一２ ｏＣ，抽滤，滤液用无水Ｎａ ＣＯ，中和至碱性，３×１ ０００ ｍＬ氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶 剂，得到白色固体．甲醇重结晶，得到白色针状晶体２３．２ ｇ，产率７２．４％．熔点：１８４～１８６℃（分解）．ＩＲ 。（ＫＢｒ）主要特征峰：一Ｎ—Ｏ １ ２９３ ｅｍ～，一Ｃ—Ｂｒ ５２４ ｅｍ～． １．２．２ Ｎ一氧化－２，６一二溴４．硝基吡啶（ＤＢＯＮＰ）（２）的合成 将ＤＢＯＰ １９．８ ｇ（０．０７８ ｍｏ１）溶于６７．８ ｍＬ浓Ｈ２ＳＯ４中，搅拌下加入６７．８ ｍＬ浓Ｈ２ｓＯ４和３４．２ ｍＬ发烟 硝酸的混合酸，升温至９０℃，搅拌２ ｈ．冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥得浅黄色固体２０．８ ｇ，产率 ８９．２％．熔点：２１９～２２１ ｏＣ，ＩＲ（ＫＢｒ）主要特征峰：一ＮＯ２ １ ３６０，１ ５２５ ｅｍ～，一Ｎ—Ｏ １ ２５７ ｅｍ～，一Ｃ—Ｂｒ ５９６ Ｃｍ－。． １．２．３ ２，６．二溴４一氨基吡啶（ＤＢＡＰ）（３）的合成 】 参考文献［８］合成．采用连续分批萃取法提取产物．室温搅拌下向１７．４ ｇ（０．０５８ ｍｏ１）ＤＢＯＮＰ中加入 ２９０ ｍＬ冰醋酸，缓慢升温，分批加入还原铁粉２３．２ ｇ，１００ ｏＣ反应１ ｈ，得到的灰白色稠状物用浓ＮａＯＨ溶液 调节ｐＨ值到９左右，冷却，在１ ０００ ｍＬ分液漏斗中倒入５００ ｍＬ乙醚，再每次倒入５０ ｍＬ反应混合物充分萃 取，直至将反应混合物全部萃取一遍．对反应混合物萃取四遍，合并乙醚层，蒸馏回收溶剂后得产物．用 （乙醇）：Ｖ（氯仿）＝１：１的溶液重结晶得白色针状晶体１１．８ ｇ，产率８０．２％．熔点：２０８～２１０℃，ＩＲ（ＫＢｒ） 主要特征峰：一ＮＨ２ ３ ４６７，３ ３０２，１ ６２７ ｅｍ～，一Ｃ—Ｂｒ ６０２ ｅｍ～，而一ＮＯ２，一Ｎ—Ｏ特征峰消失． １．２．４ ２，６一双（３一甲基一１Ｈ一吡唑基）－４．氨基吡啶（ＤＭＰＡＰ）的合成 将１０．１ ｍＬ ９５％（０．１２ ｍｏ１）３一甲基吡唑溶于７３．５ ｍＬ二甘醇二甲基醚（ｄｉｇｌｙｍｅ）中，搅拌下分批加入 ４．７ ｇ（Ｏ．１２ ｍｏ１）金属钾，升温至７０℃继续反应，待钾全部溶解后加入ＤＢＡＰ ７．５６ ｇ（Ｏ．０３０ ｍｏ１），１６３ ｏＣ下 反应９６ ｈ．冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，加入４００ ｍＬ蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末．用 （氯仿）： （正己 烷）＝２：１的溶液３００ ｍＬ分次提取，合并提取液．过滤，浓缩后重结晶，得白色针状晶体２．２８ ｇ，产率３０．０％． ＤＳＣ熔点测定：１８７．２～１８９．８ ｏＣ．ＩＲ（ＫＢｒ）主要特征峰：吡啶环１ ５３４，１ ４８３ ｅｍ～，吡唑环１５７４，１ ０４８ ｅｍ～， 氨基３ ３７６，３ ２３０，１ ６２１ ｅｍ～，甲基２ ９２６，１ ４５８，１ ３６９ ｅｍ～，而一ｃ—Ｂｒ特征峰消失．气相色谱只在 １５．７２８ ｍｉｎ出现单峰． ＭＳ ｍ／ｚ：２５４（Ｍ ，１００％），２５５（Ｍ ＋１），２５３（Ｍ 一１），１７３（Ｍ 一Ｃ４ Ｈ６ Ｎ２）．。Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ ＣＤＣＩ３）８：２．３７（６Ｈ，ｓ），４．４２（氨基２Ｈ，ｓ），６．２２（Ｐｚ（４一Ｈ），２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４ Ｈｚ），７．０１（Ｐｙ（３－５－Ｈ），２Ｈ，ｓ），８．４０ （Ｐｚ（ ＿Ｈ】，２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４ Ｈｚ）．元素分析理论值（实测值） （Ｎ）／％：３３．０５（３３．２９）， （Ｃ）／％：６１．４０（６１．４０ ）， （Ｈ）／％：５．５５（５．３１）． 维普资讯 http://www.cqvip.com
第１期 李珍等：２，６－双（３．甲基．１Ｈ．吡唑基）４．氨基吡啶的合成与表征 ４５ ２结果与讨论 ２．１ 温度对，ｖ一氧化－２。６一二溴吡啶合成的影响 文献［８］采用蒸汽浴条件下回流３ ｈ合成ＤＢＯＰ，我们重复此条件实验，发现生成的不是ＤＢＯＰ．经反复 试验，反应温度控制在４２℃左右为宜．超过４５℃生成物以黄色副产物为主．采用室温下氯仿直接萃取法可 快捷完成对ＤＢＯＰ的提取分离且避免了分离过程中副产物的生成． ２．２ ＤＭＰＡＰ合成步骤反应溶剂的选择 在物料比等条件都相同的条件下，分别以四氢呋喃（ＴＨＦ）与ｄｉｇｌｙｍｅ 作溶剂回流状态下反应，采用 ＧＦ ＴＬＣ薄板同时进行点板跟踪反应进展情况．紫外灯照射发现ＴＨＦ体系反应１６８ ｈ目标化合物ＤＭＰＡＰ 点紫色仍较浅，而ｄｉｇｌｙｍｅ体系４８ ｈ时ＤＭＰＡＰ点已呈深紫色．说明高温有利于ＤＭＰＡＰ生成，选择高沸点 ｄｉｇｌｙｍｅ作溶剂． ２．３ ＤＭＰＡＰ合成步骤反应时间对产率的影响 以ｄｉ￣ｙｍｅ作溶剂回流反应，发现随着反应时间增加，ＤＭＰＡＰ产率先升后降．反应时间选择９６ ｈ左右为 宜．随着时间的延长，反应液逐渐变为深棕色，并且棕黑色油状物增加．可能是由于在高温下２，６一双（３一甲 基一１ Ｈ一吡唑基）４．氨基吡啶自身发生了热聚合反应． 参考文献： ［１］Ｓｏｉｎｉ Ｅ，Ｈｅｍｍｉｌａ Ｉ．Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｋｅｙ ｐｒｏｂｌｅｍｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，１９７９，２５：３５３—３５５． ［２］Ｓｏｉｎｉ Ｅ，Ｋｏｊｏｌａ Ｈ．Ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ ｆｏｒ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｈｅｌａｔｅｓ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，１９８３，２９：６５—６８． ［３］Ｈｅｌｓｉｎｇｉｕｓ Ｐ，Ｈｅｍｍｉｌａ Ｉ，Ｌｏｖｅｒｅｎ Ｔ．Ｓｏｌｉｄ—ｐｈａｓｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉｇｏｘｉｎ ｕｓｉｎｇ ｔｉｍｅ—ｅｓｒｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， １９８６，３２：１７６７． ［４］Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｅ Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ・ｅｓｒｏｌｖｅｄ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｎｄ ａｐｐｌａｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８８， ２１：１３９—１５０． ［５］Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ Ｔ Ｋ，Ｌｉａｎｄｉｏｕｓ Ｅ Ｓ，Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｅ Ｐ．Ｕｈｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｉｍｅ－ｒｓｏｌｅｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍ￣ｈｅｄ ｆｏｒ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｒｉｎ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，１９９０，３６：１４９７—１５０２． ［６］Ｐｒａｔ Ｏ，Ｌｏｐｅｚ Ｅ，Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．Ｅｕｒｏｐｉｕｍ（３＋）ｃｒｙｐｔａｔｅ：ａ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ［Ｊ］． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，１９５（２）：２８３—２８９． ［７］Ｂａｉｌｅｙ Ｍ Ｐ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｆ，Ｒｏｃｋｓ Ｆ，ｅｔ ａ／．Ｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｓ ａａ ｌａｂｅｌ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｓｔ，１９８４，１０９： １４４９—１４５０． ［８］Ｂｏｊａｒｓｋａ．Ｄａｈｌｉｇ Ｈ Ｎ，Ｄｅｎｈｅｒｔｏｇ Ｈ Ｊ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｎ—ｏｘｉｄｅ ＸＶ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｎｄ ａｅａｃｔｒｉｖｉｔｙ ｏｆＮ一［４－ｏｘｏ一１（Ｈ）一ｐｙｒｉｄｙ］ｏｘｙ— ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｒｅｃ Ｔｒａｖ Ｃｈｉｍ，１９５８，７７：３３１—３３９． ［９］Ｔｉｎａ Ｖ，Ｄａｎｕｔａ Ｂ，Ａｎｔｏｎｉｕｓ Ｔ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｔｅｒｄｅｎｄａｔｅ ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｌｉｇａｎｄｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００３，５９ （２７）：５０３９—５０４５．
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