一、PCR扩增的引物设计原则：
PCR反应是一种体外选择性扩增DNA或RNA片断的方法，其特异性是由人工合成的引物序列来决定的。为了有效地扩增特定的模板，上下游引物之间必须将待研究的片断包括在内，换句话说，两条引物分别与模板双链的两翼特异性互补。在此前提下，我们必须遵循以下原则来进行引物的设计。
1. 选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度特异、碱基分布均匀的区域进行引物设计。靶基因的序列，可以从GENEBANK等数据库查阅，不同的序列可以通过BLAST等比较其同源性。 2. 长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp。
3. Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一
般不超过2℃。若引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。Tm值的计算有多种方法，简单的如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。用软件设计时注意：实际反应Tm值应为不含酶切位点的有效引物（与基因匹配的引物）的Tm。
4. （G+C）含量：（G+C）的比例一般为45～60％，最好在50-55%。
5. 碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6. 引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性，尤其避免3’末端的互补。 7. 引物之间：上下游引物之间不应有互补性，尤其应该避免3’端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。一对引物之间不应该有多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8. 引物的3’端：由于引物的延伸是从3’端开始的，所以普通PCR引物的3’端尤其不能进行任何修饰。
9. 引物的5’端：引物的5’端限定了扩增产物的长度，对扩增的特异性影响不大，所以可以根据特殊要求进行修饰，如加入酶切位点和标记等。
10.密码子的兼并：如要扩增编码区域，引物的3’端尽量不终止于密码子的第三位，因为密码子的第三位易发生兼并，会影响到扩增的特异性与效率。
11.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不应超过70％或有连续8个互补碱基同源。
12.避开产物的二级结构区：选择待扩增片断时，要尽量避开引物互补区域的二级结构，否则会因此而使引物失效。
13.设计好的引物还要www.ncbi.nlm.nih.gov网上BLAST，避免有同源序列其他基因被扩出（尤其序列较目的序列短的基因或片段会优先扩出）。指上游引物与下游引物不能同时与另外一个或多个基因（cDNA 或mRNA 序列）匹配，特别是3‘端不能有匹配，如果3‘端连续有匹配绝对不能超过5个碱基。 在实际的引物设计工作中，应该根据实际情况对上述的原则进行综合灵活地考虑，而后通过实际的实验筛选，选择最合适的引物对。
注意：各软件都各有所长，但也各有缺陷，因此在实际应用中应该在软件的自动搜索结果中再根据以上原则进行手工的校对甚至修正。
如果引物设计存在问题，请一定要老师审查后再定！！
在引物中添加酶切位点时要注意，正反向不一样的位点，在3端添加时，要先反过来再添加。
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