四JIl医学2010年1月第31卷(第1期)Sichuan Medical Journal,2010,Vo1.31,No 1 ・95・ ●检验医学● 不明原因肝炎患者隐匿性乙型肝炎病毒感染检测分析 徐峰 (眉…市人民医院检验科,四川I眉IIj 620010) 论著 【摘要】 目的探讨不明原因肝炎患者隐匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染情况及隐匿性感染的机制。方法 采用 隐匿性乙型肝炎病毒感染率为17.5%。电化学发光免疫技术检测隐匿 巢式聚合酶链反应(PCR)检测103例不明原因肝炎患者血清HBV DNA。用电化学发光免疫技术对检测出的隐匿性 HBV感染者血清HBsAg进行定量测定。结果匿性HBV感染者血清HBsAg,未检出有3例,在0.05~0.1n Inl有8例,0.1~0.5ng/ml有6例,3.5n ml有1例。隐匿 性HBV感染者血清HBV DNA水平为lO ~10。copies/ml。结论 隐匿性HBV感染是不明原因肝炎的病因之一。隐匿 性HBV感染者血清HBsAg阴性的机制主要是HBV复制和基因表达的严重抑制,以及HBV基因突变。 【关键词】 不明原因肝炎;隐匿性乙型肝炎病毒感染;巢式聚合酶链反应;乙型肝炎病毒核酸 【中图分类号】 R 446.11 9;R 512.6 2 Meishan,Meishan,Sichnan 612100,China 【文献标识码】A 【文章编号】 1004-0501(2010)01-0095-03 Analysis of occult hepatitis B virus infection in patients with cryptogenic hepatits.XU Fmg.Thei People S Hospital of 【Abstract】 objective To investiage the infection rate of occult hepatitis B virus in patients with cryptogenic hepatitis and the mechanisms of occult hepatitis B virus infection.Methods HBV DNA were determined in the sera from 103 patients with eryptogenie chronic hepatitis by nested—polymerase chain reaction.Meanwhile,the quantitation of HBsAg in the sera from the patients with occult hepatitis B viusr ifnection were detected by electro—chemiluminescence immunoassay(ECLIA).Results The infection rate of occlut hepatitis B viusr in these populations were 17.5%.The quantitation of HBsAg in the sera from 18 the patients with occult hepatitis B viusr ifenction,3 were negative,8 were between 0.05ng/ml and 0.Ing/ml,6 were between 0.1ng/ml and 0.5ng/m1.1 were between 3.5ng/m1.HBV DNA levels in the sera rom the patfients with occult hepatitis B vires infection were 10 ~10。copies/m1.Conclusion Occult hepatitis B virus infections may account for a proportion of liver diseases of unkown etiology.Negative orf HBsAg in sera rfom the subjects itwh cculot hepatitis B viusr ifnection were mostly due to a strong suppression of HBV replication and gene expression,HBV gene mutation. 【Key words】eryptogenie hepatitis;occult hepatitis B virus ifectnion;nested—polymerase chain reaction;hepatitis B viusr nllc1eic a id 血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性是乙型肝炎 平均46岁,男56例,女47例。临床表现为反复ALT 升高(>100 U/L),肝区疼痛,肝肿大。甲、乙、丙、丁、 病毒(HBV)感染的重要依据,血清HBsAg转阴及抗 HBs出现一直被认为是HBV清除和临床痊愈的标志。 但是,近年大量研究显示,部分血清HBsAg阴性者的 肝组织或血清中仍可检出HBV基因组,这种现象称为 隐匿性HBV感染,其与输血和器官移植传播HBV、不 明原因肝炎、急慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌等密切相 戊型肝炎病毒血清学标志均阴性,所有患者血清HB— sAg经两家国产试剂公司的ELISA试剂检测均阴性。 1.2血清收集:真空采血管取清晨空腹静脉血5ml, 分离血清,一40℃保存备检。 1.3主要试剂和仪器:蛋白酶K(Sigma);Taq DNA聚 合酶和dNTPs(Promega);QIAGEN病毒基因组提取试 剂盒(TIANGEN公司);50~800 bp DNA Marker(Pro— mega);HBV DNA荧光定量PCR试剂(上海复星生物 工程有限公司);乙型肝炎两对半ELISA试剂盒(两家 国产试剂公司);酶标仪和洗板机(MK一3);DNA扩增 关。 。人群隐匿性HBV感染率与该国家或地区人 群HBV感染的总体发生率有关,我国人群HBV感染 率高达57.6%,是隐匿性HBV感染存在的基础。为 此,本实验对103例不明原因肝炎患者进行了隐匿性 感染HBV检测分析。报告如下。 1资料与方法 仪(API公司);ELECSYS 2010电化学发光免疫分析仪 及配套HBsAg定量检测试剂盒(Roche公司,最低检 ~1.1一般资料:2008年1月 2009年9月本院门诊 和住院的不明原因肝炎患者 103例,年龄23~65岁, 测限0.05ng/m1) 1.4引物:据HBV S基因和C基冈各设计两对套式 ・96・ 四川医学2010年1月第3】卷(第1期)Sichuan Medical Journal,2010,Vo1.31,No.1 引物 。引物序列见表1。 表1巢式PCR检测HBV DNA的引物序列 一 位置产 S基因 ls AGA ACA TCC CAT CAG GAC TC 159—178 484 28 CATAGC TAT C1 GCC AAA GC 642—623 38 AGG ACC CCI"GCT CCT GTTAC 181~200 439 4a AGA TGA TCC GAT GGG AAT AC 619—600 C基因 l8 c1-GGGA GGA GrITGGG GGA 173o一1747 774 2a CTA GAA GAA TAA ACC CC 2503—2487 38 C,GT CTrTCTACT CCG AGG CTG 1763—1783 693 4a ATA CTA ACATrG ACA13"C CC 2455~2436 注:ls'2a为外侧引物,3s一4a为内侧引物 1.5 HBV DNA制备:采用QIAGEN病毒基因组提取 试剂盒:1001 ̄1血清严格按说明书操作制备HBV DNA。DNA溶于5O l洗提缓冲液备用。 1.6 PCR扩增反应:5O l反应液内含:引物各 0.51 ̄mol/L,dNTPs各2001 ̄mol/L,MgCl2 1.5mmmol/L, Taq DNA聚合酶1U,模板DNA 5 1。第1轮PCR(外 引物)扩增产物液2 ILl用于第2轮PCR(内引物)扩 增反应模板。PCR扩增反应条件:94℃5rain,94oC 60s,56℃30s,72℃60s,>30次循环;72℃5rain。 1.7产物检测:PClt扩增产物用15 L琼脂糖凝胶 (含0.5 ̄g/m1)电泳,紫外检测仪上观察结果,出现特 异长度DNA扩增带为阳性。 1.8隐匿性HBV感染的诊断:同一血清标本同时检 出HBV S基因和C基因,确定为隐匿性HBV感染[2]。 1.9室内质量控制:同时做HBV阳性血清对照、HBV 阴性血清对照和蒸馏水对照。所有标本均做两个平行 管,两个平行均阳性才判为S基因或C基因阳性。 2结果 2.1隐匿性HBV感染:从103例不明原因肝炎患者 中检出隐匿性HBV感染者18例,检出率17.5%。 2.2 血清HBV DNA ̄定量检测结果:l8例隐匿性 HBV感染者血清HBV DNA 10 一10 copies/ml。 2.3电化学发光免疫定量检测血清Hl3sAg:l8例隐 匿性HBV感染者中,HBsAg未检出有3例,HBsAg在 0.05—0.1rig/ml有8例,0.1~0.5n g/ml有6例, 3.5ng/ml有l例。 3讨论 引起肝损害的原因很多,临床上有5%一10%慢 性肝病患者据其临床表现、常规生化和血清学检查不 能确定原因,其中部分患者肝组织或血清中可检出 HBV DNA。本实验结果显示,不明原因肝炎患者隐匿 性HBV感染率(17.5%)较高,与不明原因肝炎密切 相关,与文献报道一致 。 电化学发光免疫技术检测HBsAg的灵敏度 (0.05ng/m1)远高于ELISA(0.5~lng/m1)。本实验 用电化学发光免疫对18例隐匿性HBV感染者血清 HBsAg定量测定结果显示,77.8%(14/18)的隐匿性 HBV感染者血清HBsAg浓度(0.05—0.5n g/m1)低于 ELISA试剂检测下限,5.6%(1/18)的隐匿性HBV感 染者血清HBsAg浓度高于ELISA检测下限,16.7% (3/18)的隐匿性HBV感染者血清采用ELISA和电化 学发光免疫均未检出HBsAg。这18例隐匿性HBV感 染者血清HBV DNA定量检测结果为10 一10 copies/ ml。实验结果提示隐匿性HBV感染主要是病毒复制 和基因表达的抑制,血清HBsAg水平低于ELISA试剂 检测下限;血清HBsAg阴性的另—个原因可能是HBV基 因突变,导致s蛋白带有异常的表位,不能被常规血清学 试剂检出¨卜 引。提高ELISA试剂的灵敏度和检测HBV 突变体的能力,将有助于“隐匿性HBV”感染的检出。 隐匿性HBV感染,虽然病毒复制水平低,但当有 其它肝损害因素共存时,机体对隐匿HBV免疫应答产 生的微小损伤可使肝病变加重,隐匿性HBV感染促成 向肝硬化发展,通过HBV致癌特性机制促成肝细胞转 化 J。因此,临床上开展隐匿性HBV感染的检测具有 重要意义。 参考文献: [1] Anna SFL.Occult hepatitis B virus infection:diag ̄lo6is impliealiom and management.'?[J].J Gastoentero|Hel ̄tol,2004,19.s114一 Sl17 [2]Giovanni R,Teresa P,Irene C,et a/.Oecuh hepatitis B virus infection [J].J 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JIANG You—hua,DENG Li—qiang,XIANG Su-fang.et a1.The People S Hospital ofSichuan,Chengdu,Sichuan 610072,China 【Abstract】0bjective To investigate the diagnostic value of color doppler uhrasonography applied in facial hemanglomas and vascularmalforamations.Metheds We reviewed and analyzed doppler the image characteristic of 36 cases.Results He. manglomas and vasculr malaforamations have various doppler the image characteristic.Conclusion The doppler have importance value in soft tissue hemanglomas and vascularmalforamations. 【Key words】doppler;tdtrasonography;hemangloma;vascular malforamations 血管瘤是一种胚胎性的良性肿瘤。浅表的皮肤血 管瘤有颜色改变,容易诊断,但大多数深部血管瘤,缺 内部和外周血流状态、血管密度。并用探头对包块进 行加压和放松相交替的超声加压试验。 2结 果 乏皮肤颜色的变化,临床上不易与其他肿瘤相鉴别。 彩超能清楚显示病变的大小、范围,对周围组织的侵犯 及供血血管的部位、内部血管的分布。现将我院经手 术及穿刺诊断证实的42例软组织血管瘤进行回顾性 分析,探讨彩色多谱勒超声对软组织血管瘤及血管畸 形的诊断价值。 1资料与方法 42例病灶均经超声检出并作出定位诊断,其中头 颈部13例,躯干部1O例,上肢8例,下肢11例。检出 率和定位准确率为100%(42/42)。超声诊断与病理 符合率为92.8%。误诊3例,1例淋巴管瘤误诊为静 脉血管畸形,1例腹壁增生性肌炎误诊为蔓状血管瘤, 1例脂肪瘤误诊为血管瘤。 1.1一般资料:本组来自2006年6月~2008年12月 我院门诊及住院的42例患者。男10例,女32例,年 龄3个月~56岁,平均19.5岁;主要临床症状:局部 血管瘤的超声图象表现分为两种类型:①低回声 实质性型l2例(28.5%)。表现为:团块回声低弱,内 部回声不均匀,边界欠清晰;彩色多普勒显示团块内部 包块,质软,边界欠清或不清,加压试验阳性/阴性。 1.2方法:采用GE730型和东芝Aplio型超声诊断 及周边有少许血流信号,加压试验一般为阴性。②混 合回声型30例(71.5%)。其病变位于皮下层7例, 累及肌肉层23例。病灶多呈蜂窝状的低回声或无回 仪,7.0—11 MHz高频线阵探头。首先行高频灰阶的 超声声像图检查,对肿瘤进行多个切面的扫查。观察 肿块的大小、范围、深度及其与周围组织的关系,内部 回声以及周边供血血管等。再以彩色多普勒观察病灶 [8] Chemin l,Jeantet D,Kay A,et a1.Role of silent hepatitis B virus in chronic hepatitis B Surface antigen(一)liver disease[J].Antivirla Res,2001,52(2):l17~123 声区,形态不规则,边界不清晰,可见高回声分隔,其中 9例可见单个或多个小强回声斑后方伴不典型声影, 即静脉石;或呈迂曲扩张的管道或管道与软组织相间 the common…a’determinant on the antigenieity of hepatitis B surface antigen[J].J Med Virol,2000,60(1):113~121 [12]Chaudhufi V,Tayal R,Nayak B,et a1.Occult hepatitis B virus infection in chronic liver disease:full—length genome and analysis of mutant sur- [9] 王霞,陈常云,张加军,等.隐匿性乙型肝炎病毒感染的检测及临 床特点分析[J].临床肝胆病杂志,2007,23(4):243~245 [1O]周小茜,徐基成,游国琼.20例不明原因肝炎患者免疫组织化学结 果分析[J].中华肝脏病杂志,2007,15(9):711 [11]Seddigh-Tonekaboni S,Waters JA,Jeeffers S,et a1.Effectof variationin face promoter[J].Gastroenterology,2004,127(4):1356~1371 [13]w eber 13.Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus:clinical and diagnostic impact[J].J Clin Viral,2005,32(1):102~112 (收稿13期:2009-03-30)