猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）是黄病毒科瘟病毒属成员，CSFV引起的猪瘟在临床上表现为高热稽留、全身各器官广泛性出血和高致死率，具有急性、热性和高度传染性，是严重威胁世界养猪业的一大疫病，因此猪瘟被国际兽疫局（OIE）列为一类传染病[1]。我国对猪瘟的防控采取猪瘟兔化弱毒疫苗的强制免疫，降低了猪瘟的发病率和死亡率，但是CSFV仍然在猪群中持续性存在，当猪群的群体免疫水平下降时，会再次引起猪瘟的爆发和流行，给养猪业造成严重的经济损失。
病毒是一种高度依赖于宿主细胞进行复制的病原微生物，它们除了自身编码蛋白拮抗宿主免疫体系外，还可以通过影响宿主细胞转录因子的表达来干扰宿主的免疫防御，达到尽可能的生存。大量研究证实很多病毒都可以通过操纵转录因子来调控宿主蛋白的表达，因此，转录因子是病毒与宿主相互作用研究中的一个热点[2,3,4]，然而，目前对CSFV调控宿主转录因子的表达和对此造成影响的研究报道甚少。本研究利用猪基因组芯片分析了CSFV感染猪后所引起的外周血单个核细胞转录因子的动态表达变化情况，筛选到37个表达差异的转录因子，如Kruppel样因子4、热休克因子结合蛋白1、干扰素调节因子7等，揭示了CSFV通过调控转录因子的表达来实现免疫逃避而获得持续性感染的分子机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物和病毒
5头75日龄健康的三元杂猪，试验前分别用RT-PCR或PCR和ELISA检测为CSFV、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪伪狂犬病毒核酸和抗体阴性。试验猪单栏饲养，自由采食、饮水。CSFV强毒石门株来自中国兽医药品监察所。 1.1.2 试剂和芯片
Trizol购自Invitrogen公司；PrimeScriptTM 1st strand cDNA合成试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；RealMasterMix (SYBR Green I)购自天根生化（北京）科技有限公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；猪基因组芯片、GeneChipIVT Labeling 试剂盒为Affymetrix公司产品；其它试剂为国
产或进口分析纯。 1.1.3 主要仪器
MJ AL079721荧光定量PCR仪（美国MJ公司）；ND-1000紫外分光光度计（美国Thermo公司）；芯片杂交炉640、芯片流控站 450、基因芯片扫描仪 3000（美国Affymetrix公司）；Advia 120 血液细胞分析仪（德国拜耳公司）。 1.2 方法
1.2.1 实验猪的病毒感染
3头猪每头肌肉注射1 mL含CSFV强毒石门株最小致死量1×106TCID50，另2头猪肌肉注射1mL PBS，作为试验阴性对照。每日直肠测温3次并记录试验猪的临床症状。为了避免实验猪在实验过程中所出现的个体差异，因此芯片杂交采取自体分析的方法进行，在攻毒前4天，对感染组的3头猪进行无菌前腔静脉采血，分离外周血单个核细胞（PBMC），作为芯片杂交的阴性对照。在攻毒后的第1、3、6和9天分别前腔静脉采血，用Advia 120 血液细胞分析仪对猪外周血细胞进行分类和计数，同时分离PBMC，作为CSFV感染的阳性样本。 1.2.2 PBMC的分离
从猪前腔静脉无菌采抗凝血10mL，用等量的PBS稀释，取5 mL上述稀释液缓慢地加入含有5 mL的淋巴细胞分离液的离心管中，2000 r/min离心20 min。将中间细胞层移至另一离心管中，加入等量的PBS混匀，2000 r/min离心20 min，去上清，沉淀细胞加入9 mL的红细胞裂解液（0.15 M NHCl4，10mM NaHCO3）去除污染的红细胞。1000 r/min离心5 min，去上清，沉淀细胞用PBS洗涤。同上再离心、洗涤3次，最后用PBS将PBMC稀释为1×107个/mL。分离得到的PBMC经瑞氏-吉姆萨染色，光学显微镜下观察其纯度>99%。 1.2.3 芯片杂交试验
用Trizol试剂抽提PBMC的总RNA，方法按说明书进行。抽提的总RNA用Dnase I在37℃作用15 min，除去污染的DNA。紫外分光光度计测定样本RNA的浓度和纯度，并将RNA进行电泳，样本RNA电泳时其28S和18S的亮度为1～2:1时，则可用于芯片杂交试验。
首先将1 μg总RNA反转录为cDNA，再用GeneChipIVT Labeling 试剂盒将其转录为生物素标记的cRNA。cRNA与芯片在芯片杂交炉内45℃杂交16 h，
杂交结束后冲洗芯片，最后在芯片流控站 450内用亲和素标记的藻红蛋白进行染色，由基因芯片扫描仪 3000读取荧光信号。 1.2.4 芯片数据分析
使用基因芯片操作软件对芯片上每组基因探针的杂交信号进行分析，产生“存在”或“不存在”的统计判断，随后，软件将属于“不存在”的基因过滤，余下的基因将被用于数据分析。使用芯片显著性分析软件对感染组和对照组的“存在”基因进行统计分析，分析数据的假阳性率置信区间，找出感染前后差异显著变化的基因。差异显著变化基因的判断标准：感染前后基因表达的变化倍数大于或小于2，假阳性率小于5%。 1.2.5 荧光定量PCR验证芯片杂交数据
将用于芯片试验的PBMC总RNA（2 μg）进行反转录后，以cDNA为模板在MJ AL079721荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应。总反应体系为20 μL，包括RealMasterMix 9 μL、上下游引物(各2 pmol/L)各0.4 μL、cDNA模板2 μL以及ddH2O 8.2 μL。反应条件为：95℃ 5 min；随后进行35个95℃ 20 s，60℃20 s，68℃20 s的循环；最后68℃ 5 min延伸。选取干扰素调节因子（IRF）3, IRF-7, TBK1、C-JUN, CREB1等5个转录因子用于验证试验，以看家基因GAPDH作为内参基因，每个样品设3个重复，根据2-∆∆Ct方法计算基因表达相对变化倍数。 2 结果
2.1 实验猪感染CSFV后的临床症状观察和病毒检测
实验猪在CSFV感染后第2天（2 dpi）体温上升到40℃，开始出现精神沉郁、呆滞、食欲减退等症状。3-4 dpi后出现便秘，随后腹泻，两眼有多量脓性分泌物。8 dpi后体温升高到42℃，病猪不食，精神萎顿，后肢麻痹、步态蹒跚，腹下、鼻端、耳根和四肢内侧等部位淤血发绀。猪感染CSFV后，白细胞显著减少，从感染前4天到9 dpi，白细胞数量由15.07+0.92×106个/mL血减少至3.67+0.34×106个/mL血，呈典型的白细胞减少症，白细胞中以淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞减少为主。血小板数量也显著下降，在9 dpi时减少至12+2.88×107个/mL血，呈血小板减少症。 阴性猪无任何临床上的症状，白细胞和血小板数量也未发生变化。
荧光定量RT-PCR在6 dpi和9 dpi的PBMC中检测到了CSFV RNA基因组，
0.310.28
拷贝数分别为104.08± 拷贝/μg RNA和 105.11±拷贝/μg RNA。应用间接免疫
荧光试验对PBMC进行了CSFV E2蛋白的检测，在6 dpi和9 dpi时观察到PBMC有绿色荧光产生，表明在PBMC中检测到了CSFV E2蛋白。在整个试验期间从阴性猪PBMC中未检测到CSFV RNA基因组和E2蛋白。
临床症状以及CSFV核酸和蛋白的检测证实了实验猪已经感染上CSFV，并且随着感染时间的延长，病毒在猪体内得到了大量的增殖。 2.2 CSFV感染后转录因子表达变化
为了研究CSFV感染过程中猪PBMC转录因子表达的动态变化，分别在1，3，6，9 dpi分离PBMC，抽提总RNA进行基因芯片杂交。芯片杂交结果显示有37个转录因子的表达发生改变，其中上调表达的有14个，下调表达的有23个（表1）。有6，3，4，1个基因在1，3，6，9 dpi开始出现表达上调，而有11，6，5，1个基因在1，3，6，9 dpi开始出现表达下调。下调表达的转录因子显著多于上调表达的转录因子。
表1 CSFV感染后转录因子的差异表达
Table 1 Differential expressions of transcription factor after CSFV infection
基因 Gene
similar to BAI1-associated protein 2-like 1 neuron-derived orphan receptor-1 alfa Kruppel-like factor 4
similar to Kruppel-like factor 10 isoform a heat shock factor binding protein 1 odd homeobox 1 protein
similar to inhibitor of DNA binding 1 isoform a
DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 1 similar to hCG2041270(NmrA-like family) interferon regulatory factor 7
interferon consensus sequence binding protein 1
similar to interferon regulatory factor 5 isoform a
signal transducer and activator of transcription 1
myocyte enhancer factor 2C V-fos
FBJ
murine
osteosarcoma
viral
基因库登录号 GenBank
accession number CK464385 NM_214247
BI399508 CK463072 BX920160 NM_213792 CK464986 CN031840 BI402723 CF789161 BF712591 BF711106 NM_213769 BE344561 CF365377
1
3
6
9 dpi
变化倍数 Fold change 1.15 1.39 2.24 1.83 -2.45 -3.08 -1.53 -1.62 -4.30 -4.45 -6.01 -2.11 -2.06 2.63 -1.18 -2.45 1.62 1.48 1.64
-3.48 2.00 1.35 -2.92 2.38 1.12 2.59
-3.38 2.97 2.89 -3.97 1.60 3.15 2.68
-2.36 3.46 2.09 -6.03 1.58 3.06 1.66
-1.64 -2.19 -2.34 -1.78 -1.29 -1.60 -2.04 -1.82 1.63 -2.15
1.94
2.05
2.21
-2.61 -4.39 -4.84 -2.48
oncogene homolog
Achaete-scute complex homolog 2
similar to nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2
similar to transcription factor B2
similar to CCR4-NOT transcription complex, subunit 7 isoform 1
similar to basic helix-loop-helix domain containing, class B
similar to myeloid leukemia factor 1
similar to hairy and enhancer of split 1
similar to regulatory factor X-associated ankyrin- containing protein isoform a similar to MYB-related protein B
similar to B-cell CLL/lymphoma 11A
similar to v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein B
similar to cAMP responsive element modulator isoform 3
similar to myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 5
similar to SC1-1
Zinc finger, AN1-type domain 5 similar to zinc finger protein 618
similar to zinc finger protein 462
similar to bromodomain adjacent to zinc finger domain, 2B
similar to zinc finger, FYVE domain containing 21 isoform 2
similar to zinc finger, NFX1-type containing 1 similar to early growth response 1 similar to E2F family member 8 similar to zinc finger, MYM-type 5
CK454919 BX916748 CN032159 CF790572 CO986403 CN154662 BX672562 CB285513 BQ599048 CN163811
2.23 3.43 1.34 1.29 -2.02 -3.18 -3.51 -2.89 1.15 1.73 2.56 2.00 -1.52 -1.86 -2.44 -1.88 -2.12 -1.88 -1.59 -1.21 2.22 2.18
1.50 3.23
2.04 3.33
2.19 1.60
BX667843 CK455705 CK466032 CK463356 BX925328 CF359777 AJ686121 CA779249 CO939399
-1.89 -2.23 -2.03 -1.79 -1.65 -1.68 -1.92 -2.23 -1.65 -2.82 -3.65 -3.66 1.85 1.62 1.95 2.25 -1.33 -1.60 -2.68 2.33 -1.04 -1.55 -2.57 -2.76 -3.86 -2.68 -1.61 -1.79 -2.77 -1.99 -1.49 -2.09 -2.99 -2.96 -2.73
CF368616 BQ597577 BF711312 BQ599740
-1.67 -1.55 -2.22 -2.03 -1.71 -2.00 -1.50 -1.41 -2.04 -2.20 -2.03 -1.66 2.36
1.60
2.72
2.75
-2.19 -4.61 -3.17 -2.76 1.63 2.29 1.83 1.60 -1.81 -2.23 -2.26 -2.04
2.3 实时定量RT-PCR验证转录因子表达变化
为了验证芯片结果的准确性，我们根据GenBank上IRF-3, IRF-7, TBK1、C-JUN, CREB1等5个转录因子的序列设计各特异性引物（表2），将用于芯片试验的PBMC总RNA进行实时定量RT-PCR，结果表明两者间差异不大（表3）。因此，芯片的结果是准确可靠的。
表2 实时RT-PCR验证芯片结果的引物
Table 2 Primer sequences for validation of microarray results by Real-time RT-PCR
基因 Gene
IRF-3
IRF-7
TBK1
CREB1
c-Jun
GAPDH 基因库登录号
GenBank accession number
NM_213770
EF195267
EU091339
AY862387
NM_213880
AF017079 引物序列(5’→3’) Primers sequences 扩增长度(bp) Length
109 159 101 100 248 225 GTG GTG CCT ACA CTC CTG G CTG TGG TCC TCT GCT AAA CG CCC ACT GAC CCT CAT AAG G CAG CCT CTC ACC AGT ATG TG TTG AGA GAT GTG GTG GGT GG CCA TCT TCC CCT ATC ACA CG AGT TGT TAT GGC ATC CTC TCC TCG TGC TGC TTC CCT GTT CT ACG ACC TTC TAC GAC GAT GC GTG ATG TGC CCG TTA CTG G TGG TGA AGG TCG GAG TGA AC GGA AGA TGG TGA TGG GAT TTC
表3 实时定量RT-PCR验证芯片结果
Table 3 Validation of microarray results by Real-time RT-PCR
基因 Gene
IRF-3
IRF-7
TBK1
CREB1
c-Jun
方法 Method
芯片 实时定量RT-PCR 芯片
实时定量RT-PCR 芯片
实时定量RT-PCR 芯片
实时定量RT-PCR 芯片
实时定量RT-PCR
1
3
6
9（dpi）
1.15 1.02 1.64 2.55 -1.05 -1.16 -1.43 -1.54 -1.19 -1.43
变化倍数 Fold change 1.26 1.24 1.52 1.34 2.59 2.68 2.95 3.60 -1.04 1.30 -1.67 -1.49 -1.31 -1.53 -1.58 -1.45 -1.64 -1.48 -2.6 -3.05
1.10 1.59 1.66 2.52 1.15 -1.08 -1.40 -1.52 -1.35 -1.93
3 讨论
外周血单个核细胞可以分泌细胞因子和产生特异性抗体，在先天性免疫和获得性免疫中起到关键作用。为了逃避宿主的免疫防御，许多病毒都可以在外周血单个核细胞中进行复制，改变其功能，导致宿主免疫抑制。近来，已有多个研究报道了CSFV可以通过影响外周血单个核细胞的功能来实现免疫逃避，
1
Heinz, F.X., Collett, M.S., Purcell, R.H., Gould, E.A., Howard, C.R., Houghton, Moormann,
R.J.M., Rice, C.M., Thiel, H.-J., 2004. Family Flaviridae. In: Fauquet, C.M., Mayo, M., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L.A. (Eds.), Virus Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Virus. Academic Press, San Diego, pp. 981-998.
2
Myungsoo J, Young S H, Minjae K, et al. Hepatitis C virus core protein suppresses NF-κB activation and cyclooxygenase-2 expression by direct interaction with IkB kinase B [J]. Virology, 2005,12(79): 7648-7657.
3
Basler C F, Amarasinghe G K. Evasion of Interferon Responses by Ebola and Marburg Viruses [J]. J Interferon Cytokine Res, 2009, 29(9): 511-520.
4
Sherry B. Rotavirus and reovirus modulation of the interferon response [J]. J Interferon Cytokine Res, 2009, 29(9): 559-567.
在潜伏期中，机体动员各种防御机能与致病因素进行斗争。
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