一、 原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、 器材与试剂
器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含：
1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、
2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；
自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、
DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、
Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、 苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、 实验步骤
操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）： 1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min； 注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理
4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的
Proteinase K（400μg/mL）处理5 分钟。其它替代方法： 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即 蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：
替代方法 1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）
替代方法 2： 将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）
替代方法 3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中，
置于微波炉中350W（低档）处理5 min。 5. PBS漂洗2次；
6. 制备TUNEL反应混合液： 处理组用50μl 1
号液+450μl 2号液混匀；
号液，
而阴性对照组仅加50μl 2
阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 2
号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl 3号液（converter-POD）于标本上，加盖玻
片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。 11. PBS漂洗3次；
12. 在组织处加50~100μl DAB底物，反应15~25℃×10min； 13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体） 对于培养细胞的预处理：
①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上； ③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min； ④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100中处理5min； ⑥PBS浸洗二次，每次5min；
后续操作如同石蜡包埋切片的6-15
四、 注意事项
1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。
3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。
4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。 6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。 7. 2
号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途
号液
径进入机体，注意防护。
8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；3
（converter -POD）液一旦解冻，以后就保存在
4℃（2~8℃）下，
至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
常见问题的原因及推荐解决方案 现象 TdT酶的浓度过高 TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润。 非特异性染色 光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） 在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液 固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失） 固定时间过长，导致交联程度过高 标记率低 减少固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭，需注意避光操作 1、 增加通透剂促渗时间 促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 2、增加通透剂的作用温度（15-25℃） 3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min） 4、0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。 支原体污染 请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释或注意控制反应时间 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定 采用推荐的固定液 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福尔马林或戊二醛固定。 可能原因 建议 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀释 注意控制反应时间，并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 荧光淬灭 荧光背景很高 TdT酶的浓度过高或反应时间过长 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。 宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。 1、 冷冻切片使用3u/ml的DNase I DNase I的浓度过低 2、 石蜡切片使用 1500u/ml的DNase I 3、 一般样本使用10u/ml DNase I 组织样本被酶从玻片消化下来 降低蛋白酶K的处理时间 阳性对照没有信号 组织样本从载玻片脱落 TdT dilution buffer：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol
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