实验八 动物肝脏中DNA的提取 一、目的 学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术 二、原理 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中， 应（4℃）进行， 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/L NaCl），但在0.14mol/L 的盐溶液中溶解度降低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L 盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 三、实验器材 1． 猪肝。 2． 722型（或7220型）分光光度计。 3． 匀浆器 4． 量筒50ml（×1）、10ml（×1）。 5． 离心机（5000r/min）。 6． 离心管。 7． 试管及试管架。 8． 吸管0.50ml（×2）、1.0ml（×2）、2.0ml（×2）、5.0ml（×1）。 四、实验试剂 1．0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠（pH6.8）。 2．0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g 及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3．95％乙醇（A．Ｒ．）。 4．NaCl固体（A．Ｒ．）。 5．5％SDS溶液：5g SDS溶于100ml 水中。 6．氯仿（A．Ｒ．）。 7．V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1。 五、操作 1． 称取猪肝8g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入相当于2倍肝重的0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min 下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min 离心20min；取沉淀。 2． 在上述沉淀中加入40ml 0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3－异戊醇混合液、4ml 5％ SDS使其终浓度为0.41％，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其浓度为1mol/L（约3.6g）。将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。 3． 在上述水相溶液中加入等体积冷95％乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。用蒸馏水溶解并定容至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。 4． 提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml 0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液中，加入1倍体积的氯仿－异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5 倍体积95％乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。 四、实验结果 是否可见DNA？颜色如何？有无断裂现象？ 实验九 酵母RNA的提取和定性检测 【实验目的】 1．学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法 2. 掌握RNA组分的鉴定方法 【实验原理】 酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的2.62％～10％)，是工业上大规模制备核酸和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的RNA提取方法，是用稀碱溶液使细胞裂解，使RNA释放到碱液中，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA；或用酸调整pH至2.5，利用等电点沉淀RNA。 RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基，各种成分以下列反应鉴定：①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物—钼蓝。②核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与苔黑酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。③嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 【器材与试剂、】 (一) 器材 1. 150ml锥形瓶 2. 沸水浴 3. 量筒 4. 移液管 5. 吸管及滴管 6. 布氏漏斗和抽滤装置 7. 试管、试管夹及试管架 8. 离心机 9. 滤纸 10. pH试纸 11. 烧杯 12. 天平 13. 酵母粉 (二) 试剂 1. 0.2% NaOH溶液 2. 95％乙醇 3. 冰乙酸 4. 无水乙醚 5. 1.5mol/L H2SO4 6. 浓氨水 7. 5％AgNO3溶液 8. 苔黑酚乙醇溶液 称取苔黑酚6g，溶解于95％乙醇100ml (冰箱中可保存1个月)。 9. FeCl3的浓盐酸溶液 取10％FeCl3 2ml，与浓盐酸400ml混合。 10. 定磷试剂 （1）17％H2SO4溶液 （2）2.5％钼酸铵溶液 （3）10％抗坏血酸溶液(贮存于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1个月。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则已失效。) 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合(限当天使用)： 17%H2SO4:2.5％钼酸铵:水:10％抗坏血酸=1:1:2:1（V:V） 【实验步骤】 （一） RNA的粗提取 1. 取酵母粉5g，置于100ml烧杯中，加入0.2％NaOH溶液20ml，搅拌成悬浮液。 2. 将悬浮液在沸水浴中加热30min，冷却至室温，分两管4000rpm离心10min。 3. 将上清液缓缓倾入95%乙醇30ml中，注意边搅拌边缓缓倾入,用冰乙酸调pH值至2.5。静置，待RNA沉淀完全后，3000rpm离心3min。 4. 弃上清，以95％乙醇10ml洗涤沉淀，3000rpm离心3min。再用95％乙醇10ml洗涤沉淀，并移入布氏漏斗中抽滤。 5. 用无水乙醚洗涤沉淀2次，每次20ml，于布氏漏斗中抽滤至沉淀干燥。 (二) 水解RNA 将提取的RNA加入5ml 10% H2SO4中，沸水浴加热10min,使RNA水解。 (三) RNA组分鉴定 1. 嘌呤碱：取试管1支，加入水解液1ml，浓氨水2ml，5％的AgNO3 1ml，观察是否产生白色絮状嘌呤银化物沉淀（放置后可能变为棕黑色）。 2. 戊糖：取试管1支，加入水解液1ml，苔黑酚-FeCI3溶液1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。 3. 磷酸：取试管1支，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。 【要点提示】 1.苔黑酚(又名地衣酚,3,5-甲苯二酚) 鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有干扰作用，在试剂中加入适量CUCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。 2. 苔黑酚鉴定戊糖时也可用下列配方： (1)苔黑酚试剂：FeCI3 0.1g溶于浓盐酸100ml，摇匀，贮存备用。使用前加入苔黑酚0.476g。 (2)苔黑酚试剂：苔黑酚0.1g溶于浓盐酸100ml中，再加FeCI3 0.1g（临用前配制）。 3．RNA中磷酸的鉴定方法有两种，原理如下： （1）钼酸铵试剂鉴定： 钼酸铵试剂：钼酸铵2g溶解于10％的硫酸100ml。 强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（NH4）3PO4·12MoO3（黄色沉淀）。 PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=(NH4)3 PO4·12MOO3·6H2O↓+6H2O (2)定磷试剂鉴定：上述反应当有还原剂存在时，MO6+被还原成MO4+，此Mo4+再与试剂中的其它MO42-结合成MO（MOO4）2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，因此也可用分光光度法定量测定RNA。 4.用乙醇沉淀RNA时，需用酸中和稀碱，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐酸1ml加入乙醇100ml中）至溶液pH至2.5。 5.用AgNO3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解度很低，加入浓氨水可消除PO43+的干扰。 【思考题】 1.用苔黑酚鉴定RNA时加入Cu2+或Fe3+的目的是什么？ 2.用AgNO3鉴定嘌呤碱基时加入浓氨水的目的是什么？