*CN102234336A*
(10)申请公布号 CN 102234336 A(43)申请公布日 2011.11.09
(12)发明专利申请
(21)申请号 201010157935.2(22)申请日 2010.04.24
(71)申请人中国科学院海洋研究所
地址266071 山东省青岛市南海路7号(72)发明人张全斌 王晶 张忠山 张虹
牛锡珍(74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限
公司 21002
代理人马驰(51)Int.Cl.
C08B 37/00(2006.01)A61K 31/737(2006.01)A61P 13/12(2006.01)A61P 3/10(2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 15 页 附图 5 页
(54)发明名称
一种岩藻半乳聚糖硫酸酯及其提取分离纯化方法与应用(57)摘要
本发明公开了一种结构新颖的岩藻半乳聚糖硫酸酯。本发明的岩藻半乳聚糖硫酸酯，是一种以岩藻糖和半乳糖组成的硫酸多糖。糖链的化学结构以-4-α-L-Fuc-(1，3)-α-L-Fuc-(1，3)-α-L-Fuc-(1，3)-α-L-Fuc-(1-残基形成主链，平均每4个糖残基含有一个支链，支链由α-L-Fuc(1-或者β-D-Gla-(1，6)-β-D-Gla-(1-组成。硫酸基连接在岩藻糖的2，4位或者半乳糖的3，4位上。本发明同时公开了其制备方法和应用。本发明的岩藻半乳聚糖硫酸酯可以开发为治疗肾脏疾病的药物。CN 102234336 ACN 102234336 ACN 102234338 A
权 利 要 求 书
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1.一种岩藻半乳聚糖硫酸酯，其特征在于：
其主要含有岩藻糖和半乳糖；糖链化学结构以-4-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1-残基形成主链，主链中1→3的岩藻糖占75％，1→4的岩藻糖占25％，平均每4个糖残基含有一个支链，支链由α-L-Fuc(1-或者β-D-Gla-(1→6)-β-D-Gla-(1-组成；硫酸基连接在岩藻糖的2，4位或者半乳糖的3，4位上。
2.按照权利要求1所述岩藻半乳聚糖硫酸酯，其特征在于：其包含两个结构单元结构A和结构B；结构A由1→3的岩藻糖和1→4的岩藻糖构成主链，在1→3的岩藻糖的2位上连有α-L-Fuc(1-支链；结构B由1→3的岩藻糖和1→4的岩藻糖构成主链，在1→3的岩藻糖的2位上连有β-D-Gla-(1→6)-β-D-Gla-(1-支链；
3.按照权利要求1所述岩藻半乳聚糖硫酸酯，其特征在于：它是由2个结构A和1个结构B的AAB结构依次交替连接构成主链，每12个岩藻糖单位构成一个重复单元；在主链的第2个和第6个岩藻糖残基的2位上连有1-连接的岩藻糖支链，在主链的第10个岩藻糖残基的4位上连有(1→6)连接的2个半乳糖单元。
4.一种权利要求1所述岩藻半乳聚糖硫酸酯的提取分离纯化方法，其特征在于：操作步骤如下：
(1)将褐藻除去泥沙，加水，60-120℃加热提取1-4次；合并提取液，抽滤，减压浓缩，用乙醇沉淀，干燥得粗提物；
所述加水的量为10-40倍藻体重量；所述的抽滤用硅藻土助滤；所述沉淀过程乙醇于体系中的最终体积浓度为50-80％；
(2)将粗提物加水复溶，使其质量浓度为1-1.5％，加入氯化镁和乙醇溶液，离心除去沉淀，收集上清液，其中所述氯化镁于复溶物中的终浓度为0.05mol/L，乙醇于体系中最终
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权 利 要 求 书
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重量浓度为20％；
上清液经减压浓缩，再加入乙醇沉淀，乙醇于体系中的最终体积浓度为50-80％，过滤得沉淀；
(3)将沉淀溶于水，用截留分子量为3500Da透析袋透析，透析结束后将袋内溶液减压浓缩，冷冻干燥得纯化的褐藻多糖；
(4)将(3)得到的褐藻多糖溶于水，使其质量浓度为1-3％，以DEAE-Sepharose-CL-6B为载体柱层析，依次用0.1mol/L NaCl、0.5mol/LNaCl、1.0mol/L NaCl、1.5mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液洗脱，收集各洗脱液，分别透析、冻干；其中由1.0mol/L NaCl洗脱所得的白色样品即为岩藻半乳聚糖硫酸酯。
5.一种权利要求1所述的岩藻半乳聚糖硫酸酯在制备治疗肾脏疾病药物中的应用。6.按照权利要求5所述岩藻半乳聚糖硫酸酯的应用，其特征在于：所述肾脏疾病药物为治疗肾功能衰竭、肾病综合症和/或糖尿病肾病的药物。
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说 明 书
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一种岩藻半乳聚糖硫酸酯及其提取分离纯化方法与应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物化学领域，具体说是一种岩藻半乳聚糖硫酸酯及其分离纯化方法
与应用。背景技术
岩藻多糖又名褐藻多糖硫酸酯，英文名称fucan或fucoidan，是存在于海洋褐藻或海洋无脊椎动物中的一大类由岩藻糖组成的硫酸化多糖，具有抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗炎等多种生物活性。现在人们对岩藻半乳聚糖的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖。
[0003] 岩藻多糖化学结构非常复杂，不同褐藻中分离到的岩藻多糖其结构有很大差异。到目前为止，对来源于墨角藻(Fucus vesiculosus)和泡叶藻(Ascophyllum nodosum)的岩藻多糖的结构研究最多，墨角藻岩藻多糖主要以α(1→3)糖苷键连接，硫酸化主要发生在C4位。对泡叶藻岩藻多糖的多项研究都表明其中存在大量的α(1→3)和α(1→4)糖苷键。此外还有几种褐藻岩藻多糖的结构被报道。昆布(Ecklonia kurome)岩藻多糖主要为α(1→3)连接，硫酸化在C4位。来源于枝管藻(Cladosiphonokamuranus)和绳藻(Chorda filum)的岩藻多糖主链均为α(1→3)的岩藻糖，硫酸化在C4位，而且，二者均有少量的2-O-乙酰化。
[0002] [0004]
[0005] [0006]
墨角藻、泡叶藻岩藻多糖结构
[0007] [0008]
昆布岩藻多糖结构
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说 明 书
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绳藻岩藻多糖结构[0010] 除了岩藻多糖中，部分褐藻中还存在化学组成和结构更为复杂的硫酸杂多糖。随着藻的种类不同分别含有半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸等其他成分。但是，对于该类硫酸杂多糖的化学结构的解析与活性研究一直是这类多糖的研究瓶颈。
[0009]
发明内容
[0011] 本发明的目的是提供一种从海洋褐藻中分离的岩藻半乳聚糖硫酸酯。其特征在于：其主要含有岩藻糖和半乳糖；糖链化学结构以-4-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1-残基形成主链，平均每4个糖残基含有一个支链，支链由α-L-Fuc(1-或者β-D-Gla-(1→6)-β-D-Gla-(1-组成；硫酸基连接在岩藻糖的2，4位或者半乳糖的3，4位上。
[0012] 本发明的另一个目的是提供该岩藻半乳聚糖硫酸酯的制备方法。
[0013] 本发明的另一个目的是提供岩藻半乳聚糖硫酸酯在治疗肾功能衰竭、肾病综合症和糖尿病肾病药物中的应用。
[0014] 从褐藻中提取的粗褐藻多糖，经DEAE-Sepharose-CL-6B凝胶色谱柱纯化，得到一种纯度较高的岩藻半乳聚糖硫酸酯。经HPLC谱图分析，如图1，岩藻半乳聚糖硫酸酯的单糖组成主要有岩藻糖和半乳糖。[0015] 为确定硫酸酯化位置，采用二甲亚砜溶剂解的方法得到脱硫酸基后的岩藻半乳聚糖，比较岩藻半乳聚糖硫酸酯和脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的一维、二维NMR谱图(表1，2和图4-8)，结合甲基化分析结果(表3)和文献数据，推出岩藻半乳聚糖硫酸酯的一级结构是以-4-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)--3-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1-残基形成主链，平均每4个糖残基含有一个支链，支链由α-L-Fuc(1-或者β-D-Gla-(1→6)-β-D-Gla-(1-组成。硫酸根连接在岩藻糖的2，4位或者半乳糖的3，4位上。其重复单元可表示如下：
[0016]
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说 明 书
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[0017]
表1脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的1H-NMR和13C-NMR数据
[0018]
[0019]
[0020]
表2岩藻半乳聚糖硫酸酯的1H-NMR和13C-NMR数据
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说 明 书
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[0021]
[0022] 表3岩藻半乳聚糖硫酸酯和脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的部分甲基化数据
[0023]
[0024]
上述岩藻半乳聚糖硫酸酯的分离纯化方法，其步骤如下所示：[0026] (1)将褐藻除去泥沙，加水，60-120℃加热提取1-4次；合并提取液，抽滤，减压浓缩，用乙醇沉淀，干燥得粗提物；所述的温度为60-120℃；所述加水的量为10-40倍藻体量；所述的抽滤用硅藻土助滤；所述的乙醇的最终体积浓度为50-80％；；[0027] (2)将粗提物加水复溶(使其浓度为1-1.5％)，加入氯化镁和乙醇溶液，离心除去沉淀，收集上清液；上清液经减压浓缩，再加入乙醇沉淀，乙醇的最终体积浓度为50-80％；其中所述氯化镁于复溶物中的终浓度为0.05mol/L，乙醇最终重量浓度为20％。[0028] (3)将沉淀溶于水，用截留分子量为3500Da透析袋透析，透析结束后将袋内溶液减压浓缩，冷冻干燥得纯化的褐藻多糖。
[0025]
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说 明 书
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(4)将(3)得到的褐藻多糖溶于水(使其浓度为1-3％)，以DEAE-Sepharose-CL-6B为载体柱层析，依次用0.1mol/L NaCl、0.5mol/LNaCl、1.0mol/L NaCl、1.5mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集各洗脱液，分别透析、冻干；其中由1.0mol/L NaCl洗脱所得的白色样品即为岩藻半乳聚糖硫酸酯。[0030] 本发明的有益效果：本发明从褐藻中提取分离纯化得到一种提供了一种岩藻半乳聚糖硫酸酯，该多糖在治疗肾功能衰竭和糖尿病肾病中有很好的疗效，在制备用于治疗慢性肾功能衰竭的药物中有着重要的应用，其市场前景广阔，价值高。附图说明
[0031] 图1岩藻半乳聚糖硫酸酯的单糖测定HPLC谱图(图A为标准单糖，图B为岩藻半乳聚糖硫酸酯)；
[0032] 图2岩藻半乳聚糖硫酸酯(A)和脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯(B)的红外谱图；[0033] 图3岩藻半乳聚糖硫酸酯(A)和脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯(B)甲基化后的红外谱图；
1
[0034] 图4岩藻半乳聚糖硫酸酯的H NMR及脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯在4.4-5.4ppm的放大谱图；
图5岩藻半乳聚糖硫酸酯的13C NMR及脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯在93-105ppm的
放大谱图；
[0036] 图6岩藻半乳聚糖硫酸酯的COSY谱图(左)及脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯在4.4-5.4ppm的放大谱图(右)；
[0037] 图7脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的HSQC谱图(左)及岩藻半乳聚糖硫酸酯部分放大谱图(右)；
[0038] 图8脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的HMBC谱图及部分放大谱图。
[0035]
具体实施方式
[0039] 以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。
[0040] 实施例1：岩藻半乳聚糖硫酸酯的制备[0041] (1)将5kg海带除去泥沙，用20倍海带重量的水在高压锅中提取3小时，控制温度100-105℃，提取2次。除去藻体，合并2次提取液，用硅藻土抽滤，滤液浓缩，加入浓缩液4倍体积的无水乙醇沉淀，过滤得粗多糖，多糖粗品得率为：4.84％。[0042] (2)将粗多糖溶于水配成质量浓度为1.5％的溶液，加入2mol/L MgCl2使MgCl2终质量浓度为0.05mol/L，同时加入无水乙醇，使乙醇终重量浓度为20％，搅拌生成沉淀，离心除去沉淀，取上清液加入95％乙醇，使乙醇终重量浓度为70-75％，搅拌生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀溶于水配成质量浓度2％的水溶液，装入透析袋内，用3500Da透析袋透析2天，浓缩透析袋内溶液，冻干得褐藻多糖，得率为2.71％。
[0043]
(3)取上述冻干得到的褐藻多糖溶于水，配成浓度为2.5％的水溶液，上样到以
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DEAE-Sepharose-CL-6B为载体柱层析，依次用0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl、1.0mol/L NaCl、1.5mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液洗脱，收集各洗脱液，分别装入3500Da透析袋内透析、浓缩透析袋内溶液冻干。其中由1.0mol/L NaCl洗脱所得的白色絮状沉淀即为岩藻半乳聚糖硫酸酯。其结构鉴定见实施例2。[0044] 实施例2：岩藻半乳聚糖硫酸酯的结构鉴定(1)岩藻半乳聚糖硫酸酯的脱硫反应。
[0046] 先用1mol/L的盐酸-吡啶对HZ001型树脂进行预处理，然后称取1.0g岩藻半乳聚糖硫酸酯溶于50mL去离子水中，经过HZ001型树脂，用蒸馏水洗10个柱体积，收集水洗组分，浓缩，用吡啶将pH调成中性，冻干得多糖吡啶盐。将0.5g上述多糖吡啶盐溶于100mL二甲亚砜-甲醇-吡啶溶液(体积比89∶10∶1)，100℃反应9h。反应结束后，将反应液透析，冻干，并通过硫酸基含量测定和红外光谱检测脱硫酸基的程度。[0047] (2)岩藻半乳聚糖硫酸酯的甲基化分析[0048] a.试剂处理
[0049] 取25g经马弗炉500℃恒温干燥4h的分子筛，加到100mL二甲亚砜中去除试剂中的微量水分；碘甲烷重蒸后存放在装有CaCl2的棕色瓶中。[0050] b.甲基化反应
[0051] 岩藻半乳聚糖硫酸酯样品置五氧化二磷干燥器中减压干燥48h，取3mg干燥多糖置于10mL离心管中，用1mL二甲亚砜溶解，通N2，加入干燥的NaOH粉末100mg，室温震荡30min，在冰浴中滴加0.8mL碘甲烷，室温震荡30min。加1mL水终止反应，用N2吹出未反应的碘甲烷，用1mL氯仿萃取2次，用水洗氯仿层(2mL*3)，氯仿层在N2流中挥干。重复3-4次直至IR谱图中羟基峰消失。[0052] c.GC/MS分析
[0053] 甲基化多糖以1mL甲酸溶解在100℃水解6h，反应结束蒸干反应液，加入2mL 2mol/L的三氟乙酸，100℃反应6h。将水解液蒸干，用甲醇洗涤(3*3mL)。将样品溶于2mL水和1mL 0.05mol/L NaOH中，加25mgNBH4，25℃反应2h，用醋酸中和，甲醇洗涤(4*3mL)，蒸干后溶于2mL水，冻干。将冻干的样品用1mL吡啶溶解，90℃反应30min，再加入1mL乙酸酐，100℃反应1h，将反应液蒸干，用二氯甲烷溶解，水洗二氯甲烷层(3*2mL)。[0054] 色谱条件：色谱柱：Fused Silicon Column 30QC3DB225；柱温从100℃开始升温，以5℃/min速度升到220℃后保温15min；进样口温度250℃；载气：氦气；质谱真空度为14.5psi；离子源：EI70ev；检测器：MSD；质量扫描范围：30-500au；进样量：1μL；流速：
[0045]
1.0mL/min。
[0055] (3)岩藻半乳聚糖硫酸酯和脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的NMR波谱分析[0056] 将岩藻半乳聚糖硫酸酯和脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯样品用氘水溶解，冻干，重复两次。再用99.97％的氘水将样品配成2-3％的溶液，用AVANCE600-MHz核磁共振仪测定DDS为内标。1H NMR和13C NMR在310K下测定。[0057] (4)实验结果
[0058] 岩藻半乳聚糖硫酸酯及其脱硫产物脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的IR谱图如图2，脱硫后样品在1250cm-1附近的强吸收峰消失，而这一位置是S＝O的伸缩振动的特征吸收，其它特征吸收的变化较少，说明脱硫是成功的且没有破坏多糖的骨架结构。
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图3是岩藻半乳聚糖硫酸酯及脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的甲基化后的红外谱图。从图中可以看出，在3700-3100cm-1羟基的吸收峰处没有峰，原来3440cm-1附近的强峰也消失了，说明羟基已经被修饰。在2960cm-1和2922cm-1处出现强峰，而原来此处是很弱的峰，这两个峰都可以归属于C-H的伸缩振动吸收峰，这些峰说明了甲基的存在，证明甲基化是完全的。甲基化分析结果如表3所示。岩藻半乳聚糖硫酸酯及脱硫岩藻半乳聚糖硫酸酯的NMR波谱分析结果如表2和3所示。[0060] 实施例3：岩藻半乳聚糖硫酸酯对慢性肾功能衰竭大鼠的治疗作用[0061] 1、慢性肾衰模型制作
[0062] 成年SPF级Wistar雄性大鼠，购进后饲以普通饲料观察一周，一般状态良好后，随机取出10只作为正常对照组(生理盐水10mL/kg)，其余50只动物称重后随即分组，用300mg/kg/d腺嘌呤口服灌胃给药每天一次，连续造模21天。造模结束后采血，每只大鼠采血2-3mL，采血后于实验室放置2小时后，3000转/分离心10分钟，取上清，检测血液肌酐和尿素氮含量，根据实验结果，取造模后动物随即分成5组，每组10只。[0063] 2.模型动物给药饲养[0064] 实验动物共6组，分别为：正常对照组(普通饲料，生理盐水10mL/kg)，模型对照组(普通饲料，生理盐水10mL/kg)，阳性对照组(海昆肾喜胶囊220mg/Kg，批号20090326，吉林省辉南长龙药业公司)组及按照实施例1的方法制备的岩藻半乳聚糖硫酸酯高(100mg/Kg)、中(50mg/Kg)、低(25mg/Kg)三个治疗组，灌胃给药28天。处死前留取心血化验血浆总蛋白(TP)、白蛋白(A)、尿素氮(BUN)、肌肝(Scr)。[0066] 3.实验结果
[0067] 表4岩藻半乳聚糖硫酸酯对慢性肾衰大鼠血液指标的测定
[0065] [0068] 样品编 号 正常组 模型组 海昆肾 喜组220 mg/kg 高剂量 组 中剂量 组
75.3±5.5 78.9±7.4
35.1±2.6 30.6±1.9# 9.4±0.9** 42.9±10.8## 69.1±3.48** 216.0±38.2## TP总蛋白 g/L
ALB白蛋白 g/L
血清尿素氮 mM/L
血清肌酐μM/L
76.1±3.6 31.3±1.9
29.1±4.2##** 154.8±23.9##**
78.9±5.8 32.2±2.7
22.9±3.4##** 134.8±13.9##** 83.6±5.9# 34.4±3.9
24.3±6.8##** 140.5±26.1##**10
CN 102234336 ACN 102234338 A 低剂量 组[0069]
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说 明 书
34.9±3.2* 25.1±4.4##**8/15页
139.9±22.6##** 79.7±5.4
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：与正常组相比有显著性差异；：与正常组相比有极显著性差异；***
[0070] ：与模型组相比显著性差异；：与模型组相比有级显著性差异[0071] 口服灌胃给药腺嘌呤所致的慢性肾衰大鼠，与正常对照组比较，血清肌酐和尿素氮水平均呈显著性升高(p＜0.01)，白蛋白明显下降(p＜0.05)。治疗30天后，岩藻半乳聚糖硫酸酯血清肌酐及尿素氮水平较模型对照组显著降低(p＜0.01)，这种作用随着剂量的增加而增强，对血清总蛋白及白蛋白水平基本没有影响(表4)。结果表明，岩藻半乳聚糖硫酸酯显示出对慢性肾衰良好的治疗及肾脏保护作用。慢性肾衰是由于多种疾病引起的肾功能缓慢的进行性缺失。血清肌酐和尿素氮是疾病严重程度的两个重要指标。岩藻半乳聚糖硫酸酯显著降低血清肌酐和尿素氮水平，意味着岩藻半乳聚糖硫酸酯有可能成为一种有前景的治疗慢性肾衰的药物。
[0072] 实施例4岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠的治疗作用[0073] 1试验材料
[0074] [0075] [0076] [0077] [0078] 1.1试验药品和试剂岩藻半乳聚糖硫酸酯，按照实施例1所述方法制备海昆肾喜胶囊，批号20090326，吉林省辉南长龙药业公司生产。链脲佐菌素：Sigma产品，批号：S-0130，临用时以pH4.4枸椽酸缓冲液配制。糖适平片(格列喹酮)：30mg/片，批号：070827，北京万辉双鹤药业有限责任公洛汀新片(盐酸贝那普利)：10mg/片，批号：X1009，北京诺华制药有限公司。葡萄糖试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20070706。尿蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20080402。尿肌酐测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20080614。尿白蛋白：放免药盒，原子高科技有限公司产品。微球蛋白放免药盒：放免药盒，原子高科技有限公司产品。胰岛素：放免药盒，原子高科技有限公司产品。1.2试验仪器
TU-1800/1800S紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司产品。全自动生化分析仪：日产，Olympus Au640。1.3试验动物Wistar种大鼠，由医科院动物所提供，合格证号：SCXK京2005-0013。1.4饲养管理饲料：天津市动物中心提供。动物实验室：室温由中央空调控制在22±2℃，湿度为50±15％。2试验方法
2.1岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠的影响选用健康雄性Wistar种大鼠130只，体重200-230g，戊巴比妥钠40mg/kg腹腔
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司。
[0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096]
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说 明 书
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麻醉，消毒后经背部切开皮肤，分离肌肉，完整摘除右侧肾脏(10只假手术组只进行手术操作，不摘除右侧肾脏)，然后缝合肌肉和皮肤，常规饲养2周后，用链脲佐菌素50mg/kg腹腔注射，48小时后，测定空腹血糖及尿糖。把符合要求(空腹血糖17.1～31.4mmol/L及尿糖强阳性)的大鼠随机均衡分为模型对照组、岩藻半乳聚糖硫酸酯高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)、阳性药对照组(糖适平15mg/kg+洛丁新1.5mg/kg)，每组均为12只，加上假手术组，共6组进行灌胃给药，灌胃容积均为1ml/100g体重，模型对照组、假手术对照组均灌胃给予等容量0.5％CMC，每天一次，每周7次，连续10周，观察并测定以下指标。[0097] (1)一般观察
[0098] 观察动物的精神状态，饮食、毛色、体重等。[0099] (2)24小时尿蛋白定量
[0100] 在大鼠代谢笼中禁食不禁水收集大鼠24小时尿液，按南京建成生物工程研究所生产的试剂盒操作说明测定尿蛋白。[0101] (3)血糖
[0102] 禁食4小时后，乙醚麻醉，毛细管眼眶取血约50μl，离心后，按南京建成生物工程研究所生产的试剂盒操作说明测定血糖。
(4)血液、尿液生化
[0104] 试验结束，收集大鼠24小时尿液后，以南京建成生物工程研究所生产的试剂盒操作说明测定尿肌酐；腹主动脉取血，用Olympus Au640全自动生化分析仪测定血肌酐、尿素氮，并计算内生肌酐清除率。[0105] (5)微量成分[0106] 试验结束，用放免法测定微量白蛋白、微球蛋白、血清胰岛素及糖化血红蛋白含量。
[0107] (6)肾脏脏器系数
[0108] 称量大鼠空腹体重及肾脏重，用100g体重大鼠的肾脏重作为肾脏系数。[0109] (7)肾脏组织病理学检查[0110] 试验结束，肾脏用10％福尔马林固定，HE染色，在光学显微镜下观察肾脏的病理改变，并计算肾小球直径及面积。[0111] 3试验结果[0112] 3.1一般观察
[0113] 假手术组大鼠体重增长明显，精神状态良好，动作自如，毛色正常；模型组大鼠明显消瘦，反应迟钝，竖毛，出现白内障的眼球为7/20；岩藻半乳聚糖硫酸酯100和50mg/kg剂量组精神状态好于模型对照组，较少竖毛，反应较好，出现白内障的眼球分别为3/20、4/16；165mg/kg剂量组和模型对照组比较，无明显差异，出现白内障的眼球为5/18，阳性药(洛汀新+糖适平)组也明显好于模型对照组，出现白内障的眼球为4/20；与模型组比较，各剂量组体重未见明显差异，结果见表5。
[0103]
3.2 24小时尿量、尿蛋白定量[0115] 与假手术组比较，给药后2、4、6、8、10周，模型组大鼠24小时尿量、尿蛋白定量均明显增加；与模型组比较，岩藻半乳聚糖硫酸酯100、50mg/kg剂量组均明显降低给药后6、
[0114]
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8、10周24小时尿量及24小时尿蛋白定量，结果见表6、表7。
[0116] [0117]
表5岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠体重的影响
[0118] [0119] [0120]
▲
：P＜0.01(与模型组比较)n：动物数
(n)
表6岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠24小时尿量的影响
[0121]
△△
：P＜0.01(与假手术组比较) *：P＜0.05 **：P＜0.01(与模型组比较)
n：动物数。
[0122]
表7岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠24小时尿蛋白含量的影响
(n)
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[0123]
[0124]
△△
：P＜0.01(与假手术组比较) *：P＜0.05 **：P＜0.01(与模型组比较)
n：动物数
[0125] 3.3血糖
[0126] 与假手术组比较，给药后0、2、4、6、10周，模型组大鼠血糖明显升高；与模型对照组比较，岩藻半乳聚糖硫酸酯100mg/kg组在给药后第8、10周明显降低大鼠血糖，阳性药(糖适平+洛汀新)组于给药后第4、6、8、10周明显降低大鼠血糖，其它给药组对大鼠血糖均无明显影响，结果见表8。
[0127]
表8岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠血糖的影响(n)
[0128]
[0129]
▲
：P＜0.01(与假手术组比较) *：P＜0.05 **：P＜0.01(与模型组比较)；n：
动物数
3.4生化指标
[0131] 与假手术组比较，模型组血清肌酐、血清尿素氮明显升高，各给药组对血肌酐均无明显影响，岩藻半乳聚糖硫酸酯50、100mg/kg剂量组对血清尿素氮均有明显降低作用。岩
[0130]
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藻半乳聚糖硫酸酯100mg/kg及糖适平+洛汀新剂量组肌酐清除率明显升高。结果见表9。
[0132] [0133]
表9岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠血肌酐、尿素氮的影响
：P＜0.01(与假手术组比较) *：P＜0.05 **P＜0.01(与模型组比较)[0135] 3.5微量成分
[0136] 与假手术组比较，模型组大鼠血清胰岛素、糖化血红蛋白、β2微球蛋白的含量明显减少；与模型对照组比较，岩藻半乳聚糖硫酸酯100mg/kg明显增加大鼠微量白蛋白，岩藻半乳聚糖硫酸酯25mg/kg升高β2微球蛋白，高、中剂量也有增加的趋势，糖适平+洛汀新也有相似作用。各给药组对其他各项指标均无明显影响，见表10。
[0134] [0137]
△△
表10岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠微量成分的影响
[0138]
：P＜0.05 △△：P＜0.01(与假手术组比较)
*
[0140] ：P＜0.05 **：P＜0.01(与模型组比较)[0141] 3.6肾脏系数：[0142] 与假手术组比较，模型组大鼠肾脏肥大，脏器系数明显增大；与模型对照组比较，岩藻半乳聚糖硫酸酯50、100mg/kg和糖适平+洛汀新剂量组肾脏脏器系数明显减小，见表11。
[0139] [0143]
△
表11岩藻半乳聚糖硫酸酯对糖尿病肾病大鼠肾脏脏器系数的影响
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[0144]
：P＜0.01(与假手术组比较) *：P＜0.05(与模型组比较)[0146] 3.7肾脏病理[0147] 结果显示，假手术组肾脏组织形态未见改变，模型组肾脏病变明显，肾小球体积增大，细胞数增多，部分肾小球毛细血管扩张，肾小管上皮细胞空泡变性，各给药剂量组肾脏病变均有不同程度的减轻；与模型组比较，岩藻半乳聚糖硫酸酯50、100mg/kg剂量组明显减少肾小球囊周长、截面积及细胞数。[0148] 4实验结论
[0149] 实验结果显示，岩藻半乳聚糖硫酸酯对大鼠糖尿病肾病有明显的防治作用。[0150] 实施例5岩藻半乳聚糖硫酸酯对甘油所致大鼠急性肾衰模型的影响[0151] 实验方法：
[0152] 取SD大鼠70只，雄性，体重200-220g，随机分为7组分别为空白对照组、模型组对照组、阳性对照I组(0.1mg/kg醋酸地塞米松)、阳性对照II组(220mg/kg海昆肾喜胶囊)、岩藻半乳聚糖硫酸酯高剂量组(100mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、低剂量组(25mg/kg)。口服连续给药3d，每天给药两次，上下午各一次，给药量为10ml/kg，于给药第4天开始造模，造模前全部动物禁水16h，除空白对照组外其余各组动物给予50％的甘油生理盐水10ml/kg，于大鼠两侧后肢肌肉注射，空白对照组注射等量生理盐水。造模后再连续给药3d，每天给药两次，上下午各一次，给药量为10ml/kg，给药结束后全部大鼠禁食，取血清分别检测肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白，取抗凝血检测红细胞、血红蛋白。
[0145] [0153]
△△
统计学处理：所有数据用对各组间进行Student`s检验，采用孙瑞元，陈志
扬，郑青山教授等主编的DAS软件对上述结果进行统计学处理，判定显著性差异。[0154] 试验结果
3.1.1对血液生化的影响
[0156] 结果显示，在甘油引起的大鼠急性肾衰模型中，模型对照组和空白对照组比较，血清肌酐、尿素氮显著升高(P＜0.05)，血清白蛋白和总蛋白在一定程度上有所降低，说明通过本试验可以建立大鼠急性肾衰模型。岩藻半乳聚糖硫酸酯以100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg的剂量连续给药7天，每天给药2次能够缓解动物肾衰症状的发生，高剂量和中剂量组显著降低了血清肌酐的含量，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；各个剂量组均能够降低血清尿素氮的含量(P＜0.05)；中剂量可以显著降低血清钙的含量与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01)；各个剂量组对血清磷的含量没有明显的影响。与同等剂量的海昆肾喜胶囊比较，岩藻半乳聚糖硫酸酯在降低血清肌酐和尿素氮的作用效果要优于海昆肾喜。结果见表12、13。
[0155]
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表12对甘油所致大鼠急性肾衰模型肌酐和尿素氮的影响(n＝10)
[0158]
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01[0160] 与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01(以下同)
[0159] [0161]
表13岩藻半乳聚糖硫酸酯对甘油所致大鼠急性肾衰模型钙和磷的影响(n
＝10)
[0162]
3.1.2对血液学的影响[0164] 结果显示，在甘油所致的大鼠急性肾衰模型中，没有引起大鼠产生明显的血液学变化，对红细胞数和血红蛋白的含量没用影响，模型与空白对照组比较没有显著性差异，岩藻半乳聚糖硫酸酯各剂量组与模型组比较没有显著性差异(P＞.05)，说明受试物急性肾衰短期给药的过程中不会引起红细胞的变化。结果见表14。
[0163] [0165]
表14对甘油所致大鼠急性肾衰模型红细胞和血红蛋白的影响(n＝10)
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结论：从以上结果分析可以看出岩藻半乳聚糖硫酸酯对甘油所致急性大鼠肾衰模型有良好的保护作用。
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