细菌16SrDNA的克隆
一． 总体安排:
分三个班，每班30人，每个班分10组，每组三人。 试验于第十三周开始。
二． 试验所需各种试剂及毫材 1．PCR引物
引物合成 5 OD
引物rdn1： 5′-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3′ 引物rdna2：5′-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3′
正向引物16Sf：5‘-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’； 反向引物16Sr：5‘ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3’，
2 实验仪器与毫材
冷冻离心机，高压灭菌锅，ZF紫外透射分析仪，凝胶电泳成像仪，电泳仪，水平板电泳槽及梳子，PCR仪各一台；移液枪每班室套；枪头和各种eppendorf管若干。
3 试剂与药品 SDS 500g
CaCl 500g Tris 500g EDTA 500g CTAB 500g 蛋白酶 K 1g Tris 饱和酚 500ml 氯仿 500ml 异戊醇 500ml T4 DNA连接酶 50ul T载体 50次 EcoRI 500U
EcoR V 500U HindIII 500U BamH I 500U Xgal 2g IPTG 5g 琼脂糖 10g
PCR 产物纯化试剂盒 50
三． 实验步骤与实验方法 1． 配置试剂 基因组DNA抽提
TE缓冲液
10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS） 20mg/ml蛋白酶K 5mol/L NaCl溶液 CTAB/ NaCl溶液 24：1氯仿/异戊醇
25：24：1酚/氯仿/异戊醇 异丙醇 70%乙醇
重组质粒DNA提取
氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存）， 溶液Ｉ，配100ml：高压灭菌20min。
50mmol ／L葡萄糖， 10mmol／L EDTA (pH8.0)，1） 25 mmol／L Tris－HCl(pH8.0) 溶液Ⅱ，配100ml：
0.4mol/L NaOH， 2%SDS （现配现用）
溶液Ⅲ（PH4.8），配100ml：
KAc 29.4g
冰醋酸11.5mL， H2O加至100（K+ 3mol/L、Ac- 3mol/L
配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L） 6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）； 4．实验准备
无菌dd water，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
2
大肠杆菌培养基
LB培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。用NaOH调pH至
7.5，灭菌后待用。加1.5%琼脂配成固体培养基。 LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，2% X-gal，4μL 20% IPTG。
2.细菌基因组DNA的小量制备
材料：细菌 试剂： TE缓冲液
10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS） 20mg/ml蛋白酶K 5mol/L NaCl溶液 CTAB/ NaCl溶液 24：1氯仿/异戊醇
25：24：1酚/氯仿/异戊醇 异丙醇 70%乙醇
步骤： 1．培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml的培养物12000rpm离心15min。 2．沉淀物加入567μl 的TE缓冲液，用吸管反复捶打使之重悬。加入30μl 10%的SDS和3μl 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。
3．加入100μl 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μl CTAB/ NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。
4．加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，离心4min。将上清液转入一个新管中。 5．加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心5min，将上清转入一只新管中。 6．加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来 ，离心去上清，用 70%乙醇中洗涤。
7．离心5min，弃上清，自然干燥，重溶于30μl 的TE缓冲液。
3 16SrDNA 基因的PCR扩增：
（1）在0.5ml Eppendorf管中加入： ddH2O 18.2μl 10×PCR Buffer 3μl MgCl2（25mM） 3μl dNTP （10 mM） 0.8μl primer 1(10pmol/μl) 1μl primer 2 (10pmol/μl) 1μl
3
模板基因组 2μl Taq酶（5U/μl） 1μl
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 30μl 石蜡油 30μl 反应程序为：94℃ 4min 94℃ 30s
56.1℃ 90s 72℃ 120s 72℃ 10min
34个循环 PCR产物纯化kit。
4． PCR产物与T载体连接
将PCR扩增产物与pUCmt Vector连接。连接反应总体积为10μL，体系组成如下：
纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0μL 10×Ligation buffer 1.0μL T载体（10ng/μL） 1.0μL T4 DNA ligase 1.0μL
共 10.0ul
混均后，4℃连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为pUCmt-16Sb。
5． 大肠杆菌感受态细胞的制备：
（1）取大肠杆菌DH5α单菌落接种于5ml LB培养基（不含抗生素）于37℃振荡
培养过夜。 （2）取1ml上述过夜培养物按1：100的稀释比例倒入100ml LB培养基中，37℃
振荡培养2小时，待细菌达到对数生长期（OD600为0.5）。
（3）将培养液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中，置冰浴中30分钟，使菌
落冷却到0℃。于4℃ 5000rpm离心5分钟，弃上清。
（4）每只离心管加入10ml冰冷的0.1M CaCl2将菌体重悬，置冰浴中30分钟，
于4℃ 5000rpm离心5分钟，弃上清。
（5）每只离心管加入2ml冰冷的0.1M CaCl2重悬，加入300μl甘油混匀后分
装到无菌的1.5ml离心管中。 （6）置-70℃冰箱保存备用。
6． 连接产物转化大肠杆菌
（1）用无菌吸头取100μl感受态细胞到1.5ml预冷离心管中，加入待转化
DNA10-100ng，轻轻混匀，在冰上放置30分钟 。 （2）将离心管放到42℃的循环水浴中热激90秒。 （3）快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却。
（4）每管加800μl LB培养基，37℃预表达培养45分钟。
4
（5）将平板置于37℃约1小时至液体被吸收。
（7）倒置平皿，与37℃培养，12小时后出现菌落。
7．碱裂解法小量提取质粒DNA
（1）用接种环将含目的基因或质粒的细菌分别在含相应抗生素的LB培养基上划
线。37℃，倒置过夜培养；
（2）将3ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml并通气良好的大试管
中，然后接入一单菌落,37℃剧烈摇匀，培养过夜；
（3）将1.5ml培养物倒入eppendorf管中，用微量离心机于4℃，12000rpm离
心30s，将剩余培养物贮存于4℃； （4）倒出培养液，尽可能清除残余液；
（5）将细菌沉淀重悬于100 μl冰上预冷的溶液I中，剧烈振荡，使细菌沉淀
在溶液I中完全分散；
（6）加入200μl新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混匀内
容物，将离心管放置于冰上3min，此时内容物应呈透明状；
（7） 加入150μl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10s，
混匀内容物，然后将管置于冰上3min；
（8） 用微量离心机于4℃，12000rpm，离心5min，转移上清至另一离心管中； （9） 加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀；
（10）4℃，12000rpm，离心2min，将上清转移到另一离心管； （11）加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于室温沉淀双链DNA； （12）用微量离心机于4℃，12000rpm，离心5min；
（13）小心吸去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出，再将附于
管壁的液滴除尽；
（14）用1ml70%的乙醇于4℃洗涤DNA沉淀；
（15）冷冻抽干或风干DNA，将其溶于30μl TE缓冲液或无菌双蒸水中。
8． 酶切与电泳鉴定 (1) 酶切：
在Eppendorf管里分别加入：（本实验中所涉及到的酶切反应都类似这一反应体系）
ddH2O 22μl Buffer 3μl 质粒 4μl
5
EcoRⅠ 1μl
------------------------------------------- 30μl
37℃, 2-3h
(2) 0.8%琼脂糖凝胶的制备
1．称取0.8g琼脂糖,置于小三角瓶中,加入100ml 1 x TAE稀释缓冲液，微波炉加热至琼脂糖完全熔化,取出三角瓶，轻轻摇匀；
2．用胶带将凝胶槽缺口封住，置工作台面上，将梳子安放在槽的凹槽内； 3．小心地将胶液倒入凝胶槽内，使之缓慢地展开直至形成约3mm厚的胶层，静置20分钟；
4．待琼脂糖凝胶液凝固后，双手均匀用力轻轻拔出梳子；
5．取下封边胶带，将凝胶连同槽放入电泳槽平台，让TAE稀释缓冲液浸没过凝胶面2mm。 (3) 加样
用移液枪将样品液与上样缓冲液按6混合后，分别加入胶板的加样孔内。加样。
(4)电泳
样品端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。观察和拍照。小心地取出凝胶槽，将凝胶在缸中染色10mins，然后在波长254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光。肉眼可观察到清晰的条带。
6
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容