一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109112109 A(43)申请公布日 2019.01.01

(21)申请号 201810845256.0(22)申请日 2018.07.27

(71)申请人 浙江大学

地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路

38号(72)发明人 王建安　胡新央　肖昌辰　(74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公

司 33201

代理人 黄美娟　李世玉(51)Int.Cl.

C12N 5/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书4页 附图1页

(54)发明名称

一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法(57)摘要

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法，所述方法是用miR-125-5p抑制物转染骨髓间充质干细胞，分泌获得改造外泌体。本发明转染miR-125-5p抑制物后的间充质干细胞所分泌的外泌体中携带miR-125-5p比例降低，进而影响间充质干细胞所分泌的外泌体的治疗功能，这种外泌体对心肌梗死的治疗作用下降，有利于后续的外泌体改造和使用。

CN 109112109 ACN 109112109 A

权　利　要　求　书

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1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法，其特征在于所述方法是用miR-125-5p抑制物转染骨髓间充质干细胞，分泌获得改造外泌体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述改造外泌体为miR-125-5p含量降低的外泌体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为：(1)将传代稳定的骨髓间充质干细胞接种至含体积浓度10％FBS的低糖DMEM培养基，在5％CO2、37℃条件下培养至细胞完全贴壁并生长到50-70％融合时，去除培养基，采用无血清低糖DMEM培养基洗涤后重悬细胞，加入miR-125b-5p抑制物和转染试剂，置于37℃、含5％CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养1天，隔日更换无血清低糖DMEM培养基继续培养1天，收集上清液a；(2)将步骤(1)上清液a在4℃下依次经300×g离心10min，去沉淀，2000×g离心10min，去沉淀，12000×g离心30min，去沉淀，将最后一次离心获得的上清液加入100KD浓缩管，4000×g离心5min，获得上清液b；(3)将步骤(2)上清液b经超高速离心机110000×g离心1h，去上清，加入PBS重悬沉淀，再次110000×g离心1h，最后获得的沉淀即为改造外泌体。

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一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法

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技术领域

[0001]本发明涉及一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法。

背景技术

[0002]心肌梗死是导致心肌组织损伤的首要病因，也是常见多发的致死性疾病。我国平均每年有200万新发心肌梗死患者，且以每年10.42％的速度递增，成为严重危害人类健康的难治性疾病之一。细胞移植疗法已成为心血管领域的研究热点。干细胞移植后可以通过分化成心肌或旁分泌的作用促进梗死区的心肌的存活，从而改善心功能。[0003]其中间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)由于来源丰富，增殖能力强，低免疫原性，是一种对心梗治疗很有前景的干细胞。目前，大量研究证实旁分泌在MSCs治疗梗死心肌中发挥重要的作用。MSCs可通过分泌大量的细胞因子和生长因子，这些因子能保护心肌细胞应对缺血缺氧损伤，促进血管新生，减轻心脏纤维化。但目前MSCs移植后驻留率低的问题仍限制了MSCs的疗效。而外泌体是一种直径在40-100nm的盘状囊泡。它可以携带多种蛋白，mirna，mrna，参与到细胞之间的通讯。外泌体在MSCs的旁分泌功能中起了主要的作用。由于外泌体来源丰富，易于改造，携带的物质容易被细胞摄取，可以避免细胞移植出现的免疫排斥反应，而且易于进行多次注射，它逐渐成为一种非常有前景的治疗手段。为了充分发挥外泌体在治疗疾病中的优势，优化外泌体的功能将有助于提高其未来的临床应用价值。

发明内容

[0004]本发明目的是提供一种骨髓间充质干细胞外泌体的改造方法，所述外泌体能够用于研究治疗心肌梗死药物的制备。[0005]本发明采用的技术方案是：

[0006]本发明提供一种骨髓间充质干细胞(MSCs)外泌体的改造方法，所述方法是用miR-125-5p抑制物转染骨髓间充质干细胞，分泌获得改造外泌体，具体为miR-125b-5p含量降低的外泌体。

[0007]进一步，所述方法：(1)将传代稳定的骨髓间充质干细胞接种至含体积浓度10％FBS的低糖DMEM培养基，在5％CO2、37℃条件下培养至细胞完全贴壁并生长到50-70％融合时，去除培养基，采用无血清低糖DMEM培养基洗涤(优选3次以上)后重悬细胞，加入miR-125b-5p抑制物(优选75μL)和转染试剂(优选90μL)，置于37℃、含5％CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养1天，隔日更换无血清低糖DMEM培养基继续培养1天，收集上清液a；(2)将步骤(1)上清液a在4℃下依次经300×g离心10min，去沉淀，2000×g离心10min，去沉淀，12000×g离心30min，去沉淀，将最后一次离心获得的上清液加入100KD浓缩管，4000×g离心5min，获得上清液b；(3)将步骤(2)上清液b经超高速离心机110000×g离心1h，去上清，加入PBS重悬沉淀，再次110000×g离心1h，最后获得的沉淀即为miR-125b-5p含量降低的外泌体。[0008]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

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本发明转染miR-125-5p抑制物后的间充质干细胞所分泌的外泌体中携带miR-125-5p比例降低，进而影响间充质干细胞所分泌的外泌体的治疗功能，这种外泌体降低了其抗心肌自噬和凋亡的作用，不利于心肌梗死后心脏重构以及心功能的恢复，对心肌梗死的治疗作用下降，这种通过调控外泌体中mirna含量的方法有利于后续外泌体的改造和制备不同外泌体药物的使用。

附图说明

[0010]图1为实施例1骨髓间充质干细胞分泌的外泌体形态学特征和表面标记图，A为外泌体的形态电镜图，B为外泌体表达CD63、Alix和CD9的western bloting图。

[0011]图2为检测不同外泌体对体外缺氧缺血清条件下心肌细胞的保护作用，A为细胞存活检测的荧光图，Con为control组、Exo为exosome组(正常MSCs的外泌体)、ExoNC为exosome组(MSCs经过mir-125b抑制物阴性对照预处理提取的外泌体)、ExomiR-125b-5p为实施例1步骤2制备的外泌体，B为图A的统计结果。

[0012]图3为检测不同外泌体对小鼠心梗模型中心肌细胞的保护作用，A为心梗后注射不同外泌体1天后心肌细胞凋亡的荧光图，myocardial infraction(MI)为心肌梗死，Con为control组(心梗后注射等体积到磷酸盐缓冲溶液)、Exo为exosome组(心梗后注射正常MSCs的外泌体)、ExoNC为exosome组(心梗后注射MSCs经过mir-125b抑制物阴性对照预处理提取的外泌体)、ExomiR-125b-5p为实施例1步骤2制备的外泌体，B为A图的统计结果。具体实施方式

[0013]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0014]实施例1[0015]1、第5代骨髓来源的间充质干细胞(MSCs，杭州易文赛生物技术有限公司)常规培养于含10％FBS(v/v)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的低糖DMEM培养基(美国corning公司)中，一旦融合，采用0.25％胰酶(w/v)-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA，w/v，吉诺生物医药技术有限公司)消化传代。[0016]2、待MSCs生长至70％融合度，去除常规的含10％FBS的低糖DMEM培养基，采用无血清低糖DMEM培养基洗涤3次以上，随后添加miR-125b-5p抑制物(购于锐博公司)75μL和转染试剂(购于锐博公司)90μL(培养：14.835ml)，置于37℃、含5％CO2饱和湿度的细胞培养箱(Forma 3111，美国Thermo Fisher公司)内培养1天。隔日更换无血清低糖DMEM培养基继续培养1天。收集上清液，将上清液在4℃下依次经300×g离心10min，去沉淀，2000×g离心10min，去沉淀，12000×g离心30min后，去沉淀。将最终获得的上清经100KD浓缩管，4000×g，5min(离心加速度为3)浓缩。将浓缩后的上清经超高速离心机110000×g离心1h，去上清，加入PBS重悬沉淀，再次110000×g离心1h。最后获得的沉淀即为改造外泌体(即mir-125b-5p含量降低的外泌体)，加入少量PBS重悬外泌体，用于后续处理。[0017]正常对照外泌体：待MSCs生长至70％融合度，去除常规的含10％FBS的低糖DMEM培养基，采用无血清低糖DMEM培养基洗涤3次以上，更换无血清低糖DMEM培养基继续培养1天。收集上清液，将上清液在4℃下依次经300×g离心10min，去沉淀，2000×g离心10min，去沉

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说　明　书

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淀，12000×g离心30min后，去沉淀。将最终获得的上清经100KD浓缩管，4000×g，5min(离心加速度为3)浓缩。将浓缩后的上清经超高速离心机110000×g离心1h，去上清，加入PBS重悬沉淀，再次110000×g离心1h。最后获得的沉淀即为正常MSCs的外泌体，加入少量PBS重悬外泌体，用于后续处理。

[0018]阴性对照外泌体：待MSCs生长至70％融合度，去除常规的含10％FBS的低糖DMEM培养基，采用无血清低糖DMEM培养基洗涤3次以上，随后添加miR-125b-5p抑制物阴性对照(购于锐博公司)75μL和转染试剂(购于锐博公司)90μL，置于37℃、含5％CO2饱和湿度的细胞培养箱(Forma 3111，美国Thermo Fisher公司)内培养1天。隔日更换无血清低糖DMEM培养基继续培养1天。收集上清液，将上清液在4℃下依次经300×g离心10min，去沉淀，2000×g离心10min，去沉淀，12000×g离心30min后，去沉淀。将最终获得的上清经100KD浓缩管，4000×g，5min(离心加速度为3)浓缩。将浓缩后的上清经超高速离心机110000×g离心1h，去上清，加入PBS重悬沉淀，再次110000×g离心1h。最后获得的沉淀即为阴性对照外泌体，加入少量PBS重悬外泌体，用于后续处理。[0019]3、外泌体的形态和表面标记CD63、Alix分别用电镜和western bloting检测，形态学特征和表面标记见图1，电镜显示间充质干细胞来源的外泌体形态学特征，western bloting显示外泌体表达CD63、Alix和CD9。[0020]4、利用live/dead试剂盒(life公司)评价外泌体体外保护心肌的能力。取新生(24h内)的乳小鼠，处死后，浸入酒精中。取出乳鼠后沿3，4肋间开胸取心尖部组织，用预冷PBS冲洗。将组织块剪成1-3mm大小后，加入10ml含有0.05％胰酶和0.05％2型胶原酶的消化液。放入37℃恒温摇床中振动10min，取出静置后，吸取上清置入含10ml 10％FBS的高糖DMEM培养基的50ml离心管中中和消化液。剩余组织按上述方法重复消化4-5遍，视剩余组织量而定结束消化。收集全部混合液，1000rpm离心8min，去上清，加入含10％FBS的高糖DMEM培养基，吹打重悬沉淀，种入T25培养瓶中，差速贴壁1.5h后，取上层未贴壁细胞悬液，加入终浓度为100μmol/L的Brdu(Sigma公司)抑制成纤维细胞后，直接用细胞计数板计数细胞。按照每孔10^5接种于含10％FBS的高糖DMEM培养基的6孔板中，在37℃，5％CO2恒温条件下培养48h后换液，加入含10％FBS的高糖DMEM培养基。加入不同来源的外泌体每ml培养基中加入5μg，将培养板置于37℃、0.5％O2、5％CO2恒温缺氧培养箱中，缺氧缺血清24h(Con为空白对照组(等体积的磷酸盐缓冲溶液，不加外泌体)、Exo为正常对照组(正常对照外泌体)、ExoNC为阴性对照组(阴性对照外泌体)、ExomiR-125b-5p为试验组(改造外泌体))。用live/dead试剂盒(Thermo)检测心肌细胞的存活情况，评价结果见图2，可见携带有mir-125b-5p抑制物的外泌体不能保护心肌细胞，外泌体中miR-125对保护心肌至关重要。[0021]5、利用小鼠急性心梗模型的体内移植来评价MSCs外泌体的体内保护心肌的能力：C57小鼠(浙江省医学科学院动物中心)经水合氯醛麻醉后，气管插管，小动物呼吸机支持，开胸，用7-0丝线在左心耳下方结扎左前降支冠脉，根据心电图变化和局部组织颜色变化确定心梗模型制成，关胸。在梗死周边区分5个点注射，共5μg的外泌体(外泌体分为：MI组为心肌梗死，Con为空白对照组(等体积的磷酸盐缓冲溶液)、Exo为正常对照组(正常对照外泌体)、ExoNC为阴性对照组(阴性对照外泌体)、ExomiR-125b-5p为试验组(改造外泌体))。24小时后，引颈处死小鼠，取出心脏左室，冰冻oct包埋留做冰冻切片，Tunnel染色检测心肌细胞凋亡情况，结果见图3所示，显示携带有mir-125b-5p抑制物的外泌体不能保护心肌细胞。

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结论：外泌体中microRNA(miR-125b-5p)对外泌体的功能发挥起到重要的作用，通

过上述方法能对外泌体进行改造，改变其中microRNA的比例能进一步影响外泌体的功能。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

图3

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