・６５６・生堡塞坠窆Ｅ登苤查垫！鱼生！旦筮！！鲞笠！塑ｇ！ｉ！！曼翌！！瑾：型塑！！！！！：！！！：！！ｔ盟！：！・实验研究・三种大鼠肝细胞分离及原代培养方法的比较杨友生瞿祥春胡松作者单位：４３００５０武汉，江汉大学附属第二医院重症医学科通信作者：胡松，Ｅｍａｉｌ：ｈｕｓｏｎ９９１９＠１６３．ｃｏｍＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．０３．０３２【摘要】目的比较３种大鼠肝细胞原代分离培养方法的差异。方法采用原位两步胶原酶灌流法（Ａ法）、离体两步灌流法（Ｂ法）及剪切消化法（ｃ法）３种方法分离大鼠肝细胞，采用血细胞计数法计数肝细胞产量，采用０．４％锥虫蓝染色观察细胞活力，Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液密度梯度离心法纯化肝细胞至活力在９２％以上，然后接种于杜尔伯科改良伊格尔培养基（ＤＭＥＭ）一Ｆ１２培养基中培养，糖原染色（ＰＡＳ）法鉴定肝细胞，倒置相差显微镜观察肝细胞形态，定期收集肝细胞培养液上清检测葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）、天门冬氨酸氨基转移酶（ＡＳＴ）及白蛋白的水平。结果Ａ、Ｂ、ｃ法分离获得的肝细胞总数分别为（２．１４±０．６６）×１０８、（２．０９±０．５８）×１０８、（１．１６±０．０３）×１０８个／整肝，ｃ法与Ａ法对比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；Ａ、Ｂ、Ｃ法获得的大鼠肝细胞活力分别为（９３．８０±４．６８）％、（８４．４０±２．４３）％、（３８．９５±４．８９）％，Ｂ法与Ａ法对比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），ｃ法与Ａ法对比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；培养液上清葡萄糖水平在３—１１ｄ维持在一个稳定水平；ＡＳＴ、ＡＬＴ水平在培养３ｄ后下降显著，６—９ｄ后维持在相对稳定的水平。白蛋白的分泌功能第７天达高峰，１１ｄ内维持在较稳定水平。培养液上清第７天上述生化指标，Ｂ法和ｃ法与Ａ法对比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论Ａ、Ｂ、Ｃ３种分离方法均成功分离并原代培养了肝细胞，ｃ法获得的肝细胞产量和活力较低。ＤＭＥＭ．Ｆ１２培养条件下肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力，实验显示第５～１１天为肝细胞体外功能研究的最佳阶段。【关键词】肝细胞；分离方法；原代培养；对比研究；大鼠Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｉｓｏ－ｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｐｒｉｍａｒｙｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ‰增Ｙｏｕｓｈｅｎｇ，ＱｕＸｉａｎｇｃｈｕｎ，ＨｕＳｏ昭ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＵｎｉｔ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＪｉａｎｇｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００５０，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：Ｈｕｓｏｎｇ．Ｅｍａｉｌ：ｈｕｓｏｎ９９１９＠１６３．ｃｏｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｍｅｔｈｏｄｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｐｒｉｍａｒｙｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＲａｔｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｉ－ｓｏｌａｔｅｄｂｙｔｗｏ—ｓｔｅｐｉｎｓｉｔｕｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｐｅｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ（ｍｅｔｈｏｄＡ），ｔｗｏ—ｓｔｅｐｉｎｖｉｔｒｏｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｐｅｆｕ－ｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ（ｍｅｔｈｏｄＢ）ａｎｄｂｙｍａｃｈｉｎｅｍｅｔｈｏｄ（ｍｅｔｈｏｄＣ）．ｔｈｅｙｉｅｌｄｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｂｌｏｏｄｃｅｌｌｃｏｕｎｔｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙ０．４％ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ．Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｌｉｖｅｒｃｅｉｌｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｐｅｒｉ—ｏｄｉｃａｃｉｄ—Ｓｃｈｉｆｆｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＡＳ）．ａｎｄｔｈｅｎｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｄｅｎｓｉｔｙａｎｄｇｒａｄｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈＰｅｒｅｏｌｌｔｏａｂｏｖｅ９２％ｏｆｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｉｎｔｏ６ｗｅｌｌｓｐｌａｔｅｗｉｔｈＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉ．ｆｌｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）一Ｆ１２ｍｅｄｉｕｍ．Ｇｌｕｃｏｓｅ，ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ），ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉ．ｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ、ａｎｄＡｌｂｕｍｉｎｉｎｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＡｕｔｏ—ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ（２．１４±０．６６）×１０８ｃｅｉｌｓ／ｗｈｏｌｅｌｉｖｅｒｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｍｅｔｈｏｄＡ。Ｂｗａｓ（２．０９±０．５８）×１０５ｃｅｌｌｓａｎｄＣｗａｓ，（１．１６±０．０３）×１０８ｃｅｌｌｓ／ｗｈｏｌｅｌｉｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＣａｎｄＡ（Ｐ＜０．０１）：ＴｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｅｔｈｏｄＡｗａｓ（９３．８０±４．６８）％，Ｂｗａｓ（８４．４０±２．４３）％ａｎｄＣｗａｓ（３８．９５±４．８９）％．ｔｌｌｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＢａｎｄＡ（Ｐ＜０．０５），ａｌｓｏＣａｎｄＡ（Ｐ＜０．０１）．卟ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｎａｎｄａｌｐｈａｆｅｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｉｎｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｔｈｅｇｌｕ・ｃｏｓｅｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗｅｒｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄａｔｓｔａｂｌｙｌｅｖｅｌｓｆｒｏｍｔｈｅ５ｔｈｔｏ１１ｔｈｄａｙ．ｔｈｅＡＳＴａｎｄＡＬＴｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｄｒｏｐｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｔｅｒ３ｒｄｄａｙ，ａｎｄｗｅｒｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄａｔｓｔａｂｌｙｌｅｖｅｌｓｆｒｏｍｔｈｅ５ｔｈｔｏ９ｔｈｄａｙ：Ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆａｌｂｕｍｉｎｆｒｏｍｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔｐｅａｋｅｄａｔ５—７ｄａｙｓ．ａｌｌｔｈｏｓｅｌｅｖｅｌｓａｂｏｖｅｉｎ７ｔｈｄａｙｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎＢ．ＣａｎｄＡ（Ｐ＞０．０５）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＲａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｍｅｔｈｏｄＡ，ＢａｎｄＣ，ｔｈｅｙｉｅｌｄａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｂｙｍｅｔｈｏｄＣｗａｓｓｌｉｇｈｔｐｏｏｒ．ＴｈｅｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｇｏｏｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎＤＭＥＭ—Ｆ１２ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ．Ａｎｄｔｈａｔｔｈｅｄｕｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅ５ｔｈｔｏ１１ｔｈｄａｙｏｆｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｗａｓｔｌｌｅｏｐｔｉｕｍ万方数据史堡塞墅处型盘查２１１ｉ生！旦筮翌鲞筮！塑堡堑！』堡翌兰！垡：丛！些２Ｑ！！：！尘：塑：盟！：！ｐｅｒｉｏｄｔｏｒｅｓｅａｒｃｈＷｏｒｋ．・６５７・【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅ；Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｒａｔｓ我们在既往实验过程中尝试原位两步灌流法‘１Ｊ及剪切消化法旧。分离肝细胞并进行体外实验，均获得成功，遂选择目前较广泛应用的原位两步灌流法、离体灌流法及剪切消化法３种分离方法进行大鼠肝细胞的分离及原代培养，并对其产量、活力、形态学及生物学功能进行对比。材料与方法１．材料：雄性纯系３～４周龄ＳＤ大鼠，体重１９０～２２５ｇ，购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。主要试剂：Ⅳ型胶原酶（Ｇｉｂｃｏ公司）；杜尔伯科改良伊格尔培养基（ＤＭＥＭ）一Ｆ１２培养基（Ｇｉｂｃｏ公司）；肝细胞生长素（Ｇｉｂｃｏ公司）；胰岛素（Ｇｉｂｃｏ公司）；Ｐｅｒｃｏｌｌ细胞分离液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司）；其余试剂均为国产分析纯。无钙灌流液：每升含ＮａＣｌ８．３ｇ，ＫＣｌｇ，Ｎａ２ＨＰ０４・１２Ｈ２００．２５ｌ３ｇ，乙二胺四乙酸（ＥＤ—ＴＡ）０．１８６ｇ，４．羟乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）２．４ｇ，ｐＨ值７．４。Ⅳ型胶原酶灌流液：每升含Ⅳ型胶原酶０．５ｇ，ＮａＣＩ３．９ｇ，ＫＣｌ０．５ｇ，ＣａＣｌ２０．７９，Ｎａ２Ｐ０４・１２Ｈ２０ｇ，ＥＤＴＡ２．４ｇ，ＨＥＰＥＳ２．４ｇ，ｐＨ值７．４。实验仪器：二氧化碳培养箱（ＭＣＯ－１５ＡＣ，上海）；高速冷冻离心机（ＴＧＬ．１６Ｇ．１，上海）；低温冰箱（一４０℃，ＦｏｒｍａＳｃｉ—ｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）；全自动生化分析仪（ＴＭＳ一１０２４，日本）。２．肝细胞分离：（１）原位胶原酶灌流法（Ａ法）：参照Ｓｅｇａｌｅｎ等【３１及Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ等Ｈ１方法略加改进，乙醚麻醉后，断头放血，７５％乙醇消毒并固定，逐层切开腹壁、剪开腹膜，暴露门静脉后插人１８号硬膜外麻醉导管并固定，剪开下腔静脉，先用３７ｑＣ预热无钙液灌流液１００～２００ｍｌ灌流，约５ｍｉｎ，流速４０ｍｌ／ｍｉｎ，灌流至肝脏表面呈灰白色后，然后用预热到３７℃的Ⅳ型胶原酶灌流液８０～２００ｍｌ循环灌流，流速３０ｍｌ／ｍｉｎ，持续灌流６～８ｍｉｎ，至肝表面呈“龟背状”，游离肝脏，在玻璃器皿中撕开肝包膜，在冷ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养基（终止Ⅳ型胶原酶的消化作用）中刷下肝细胞，２００目滤网过滤，过滤液移入５０ＩＩｌｌ离心管，４００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，弃上清，反复清洗、离心３次，沉积的肝细胞用ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养基制成悬液，计数产量及活力后，用Ｐｅｒｅｏｌｌ分离液纯化至活力大于９２％以上，然后调成１×１０９／Ｌ肝细胞悬液并培养。（２）离体胶原酶灌流法（Ｂ法）：参照Ｇｅｌｌｅｒ等陋１方法略加改进，同Ａ法门静脉内置管，取下整个肝脏，然后置于无菌弯盘灌流，后同Ａ法。（３）剪切消化法（ｃ法）：参照王琳等∞ｏ方法略加改进，同Ａ万方数据法入腹后，取下肝脏，剪切成５ｍｍ的细小组织块，无钙灌流液反复冲洗，加入Ⅳ型胶原酶灌流液于３７℃温箱中消化２～３ｈ，１５ｍｉｎ摇动１次，隔１ｈ轻轻吹打１次，用冷ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养基终止Ⅳ型胶原酶的消化作用，后同Ａ法。３．肝细胞培养：上述方法分离液纯化的肝细胞用ＤＭＥＭ．Ｆ１２完全培养基调成１×１０９／Ｌ悬液，于３７℃、５％ＣＯ，条件下置培养箱培养。培养２４ｈ后首次换液，以后每４８ｈ换液１次，每次换液留取培养液上清标本置一４０℃冰箱待检测各项指标。４．肝细胞鉴定：糖原染色（ＰＡＳ）法鉴定肝细胞。５．产量及活力：以血细胞计数板计算肝细胞的产量，０．４％的锥虫蓝拒染实验检测肝细胞的活力。６．肝细胞形态观察：用倒置相差显微镜对肝细胞进行形态学观察。７．肝细胞功能检测：定期收集肝细胞培养液上清用全自行生化仪检测葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）、天门冬氨酸氨基转移酶（ＡＳＴ）、白蛋白（ＡＬＢ）水平。８．统计学方法：计量资料用均数±标准差（孟±ｓ）表示，应用ＳＰＳＳ１３．０统计软件分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。结果１．肝细胞产量及活力：本实验３种分离方法均成功分离出肝细胞，Ａ法和Ｂ法获得的肝细胞产量差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但肝细胞活力差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；Ｃ法获得的肝细胞产量及活力均较低，与Ａ法比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。新分离的肝细胞显微镜下可观察到大量红细胞及细胞碎片，经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离液进一步纯化后肝细胞的活力、纯度显著增高，均在９２％以上，显微镜下几乎不见红细胞等杂质细胞和细胞碎片（表１）。２．肝细胞功能：通过自动生化分析仪检测肝细胞的功能。结果显示，ＡＳＴ、ＡＬＴ水平在培养３ｄ后下降显著，６～９ｄ后趋于相对稳定的水平。肝细胞对葡萄糖的利用逐渐上升，在３～１１ｄ维持在一个稳定水平。肝细胞分泌白蛋白的能力在第７天达最高峰，１１ｄ内维持在一个较稳定水平。以上说明３种方法获得的肝细胞在１周时间点左右功能最稳定，有良好的生物合成代谢能力，适合肝细胞的体外功能研究。取第７天培养液上清各项指标做统计学分析（表２），Ｂ、ｃ法与０．５０．２５・６５８・史堡塞堕窆Ｅ型盘查！！！鱼生！旦筮！！鲞筮！塑垦！ｉ！』垦翌！！强：丛！翌！垫！！：！！！：！！：塑！：！Ａ法比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），说明３种方法获得的肝细胞在合成代谢功能上无明显差异。表１肝细胞收获量和成活率（ｎ＝９，面±ｓ）将肝组织内的红细胞尽可能冲洗干净，消化液可分布至每个肝细胞周围，均匀并且同步消化，所以分离效果好，收获肝细胞多且活性高，结果稳定，重复性好，是分离肝细胞的可靠方法。本实验结果显示，从肝细胞的形态学及功能上，３种方法获得的肝细胞经分离纯化后，形态学及生物学功能无明显差异。因此，３种方法均可成功获得肝细胞，其形态学及注：Ａ法：原位两步胶原酶灌流法；Ｂ法：离体两步灌流法；Ｃ法：剪切消化法；与Ａ法比较，８Ｐ＜０．０５，与Ａ、Ｂ两法比较，“Ｐ＜０．０１功能并无明显差异，但剪切消化法获得肝细胞产量及活力低。参考文献［１］杨友生，瞿祥春，李树生．瘦素对培养大鼠原代肝细胞葡萄糖吸收及肝细胞膜胰岛素受体磷酸化的影响［Ｊ］．内科急危重症杂志，２００８，１４（４）：１７８—１９０．Ｙａｎｇ表２第７天培养液上清葡萄糖、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＢ水平（ｎ＝９，孟４－ｓ）ＹＳ，ＱｕＸＣ，ＬｉＳＳ，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｌｅｐｔｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄＩｎｔｅｎｓｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅｈｅｐａｔｉｃ注：Ａ法：原位两步胶原酶灌流法；Ｂ法：离体两步灌流法；Ｃ法：剪切消化法；ＡＬＴ：丙氨酸氨基转移酶；ＡＳＴ：天门冬氨酸氨基转移酶；ＡＬＢ：白蛋白；与Ａ法比较，８Ｐ＞０．０５ｃｅｌｌｓＩＪ】．Ｉｎｔｅｒｎａｌ１９０．ＪＣｈｉｎａ，２００８，１４（４）：１７８．讨论ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－１０２４．２００８．０４．００４．［２］徐华强，杨友生，李树生，等．ＴＮＦ－Ｏｔ对亚低温条件下大鼠肝细胞糖代谢的影响［Ｊ］．华中医学杂志，２００７，３１（３）：２０９－２１０．ＸｕＨＱ，ｒａｎｇＹＳ，ＬｉＳＳｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＴＮＦ－ｄｐｍｇｌｙｅｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｕｎｄｅｒｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａｉｎｒａｔｓ［Ｊ］．ＣｅｎｔｒａｌＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＪ，２００７，３１（３）：２０９－２１０．ＤＯＩ：１０．７６６６／ｄ．ｄ０９０５５１．本研究结果显示，从细胞得率和细胞活力角度来看，原位灌流消化法较优，实验结果稳定，剪切消化法获得的肝细胞产量及活力均较低。门静脉插管离体灌注结合胶原酶消化法分离肝细胞虽细胞总收获量与门静脉插管原位灌注结合胶原酶消化法相差不大，但由于门静脉置管不易固定，在取肝过程中容易脱出或置［３］ｓ嘲ｅｌｌＰＯ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｒａｔｌｉｖｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＣｅｌｌＢｉ—ｏｌ，１９７６，１３：２９－８３．ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ００９１－６７９Ｘ（０８）６１７９７－５．［４］ＤｅｍｅｔｒｉｏｕＡＡ，ＷｈｉｔｉｎｇＪ，ＬｅｖｅｎｓｏｎＳＭ．Ｎｅｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈｏｄｏｆｈｅｐｔｏｅｙｔｅｅｘｔｒａｏｒｐｏｒｅａｌｌｉｖｅｒｓｕｐｐｏｒｔ［Ｊ］．ＡｎｎＳｕｒｇ，１９８６，２０４（３）：２５９－２７１．ＤＯＩ：１０．１０９７／０００００６５８—１９８６０９０００－００００５．［５］ＧｅｌｌｅｒＤＡ，ＤｉＳｉｌｖｉｏＭ，ＮｕｓｓｌｅｒＡＫ，ｅｔａ１．Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅｅｘ—ｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｉｎｄｕｃｅｄｉｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｉｎｖｉｖｏｄｕｒｉｎｇｈｅｐａｔｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ入深度改变，使灌流不充分或不能进行，细胞活性低于门静脉插管原位灌注结合胶原酶消化。用剪切消化法获得的肝细胞产量少，细胞活性差，可能与操作过程中必须依赖机械剪切和强力吹打才能使肝细胞之间分离，刀剪的机械性损伤使细小组织块周围的肝细胞多［６］［Ｊ］．ＪＳｕｒｇＲｅｓ，１９９３，５５（４）：４２７４３２．ＤＯＩ：１０．１００６／ｊｓｒｅ．１９９３．１１６４．王琳，徐建波，田元，等．一种分离新生小鼠肝细胞的简单方法［Ｊ］．中国优生与遗传杂志，２００７，１５（１）：１０．１２．ＷａｎｇＬ，ＸｕＪＢ，ＴｉａｎＹ，ｅｔａ１．Ａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌ．ｔｕｒｅｏｆｈｅｐａｔｏｃｖｔｅｓｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒ『Ｊ］．ＣｈｉｎＪＢｉｒｔｈＨｅａｌｔｈ＆Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，２００７，１５（１）：１０—１２．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１００６－９５３４．２００７．０１．００４．受损有关。门静脉插管原位灌注结合胶原酶消化法能（收稿１３期：２０１６ｍ１．１７）欢迎订阅《中华实验外科杂志》《中华实验外科杂志》是中华医学会主办的中华医学会系列杂志之一，是外科学类核心期刊，国家科学技术部中国科技论文统计源期刊，中国生物医学核心期刊，以“探讨理论，更新知识，指导科研，服务临床”为办刊宗旨，其内容包括外科各个专业，是紧密结合临床实践的全国实验外科专业刊物。本刊设有“论坛”、“述评”、“实验研究”、“临床研究”、“新技术与新方法”、“动物模型”、“简报”、“综述”等栏目。创刊３０余年来，本刊立足外科前沿，评论医学资讯，报道实验外科最新科技成果，回答外科工作者关心的问题，内容新颖，信息量大，杂志被引频次与影响因子逐年增加，已成为我国中高级外科医师学术交流的重要园地。《中华实验外科杂志》为月刊，大１６开本，每月８号出版，每期定价１５．００元，全年１８０．００元。国际标准刊号：１００１－９０３０，国内统一刊号：４２—１２１３／Ｒ，邮发代号：３８＿８５。编辑部地址：武汉市武昌区东湖路１６５号；邮政编码：４３００７１；联系电话：（０２７）８７８９３４７５：Ｅｍａｉｌ：ｃｊｅｓ＠ｃｍａ．ｏｒｇ．ｃｎ欢迎投稿！欢迎订阅！本刊编辑部万方数据