高效液相色谱法同时测定加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂

防腐剂和抗氧化剂

符春花，申

磊，楚

浩，刘小美，吴泽君*

（株洲市食品药品检验所，湖南株洲412000）

摘要：针对加工肉制品基质复杂，采用固相萃取的样品前处理方式，建立二极管阵列高效液相色谱法梯度洗脱同时

测定加工肉制品中的防腐剂和抗氧化剂。采用XtimateC18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱分离，以甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液为流动相梯度洗脱，标准曲线法定量。防腐剂、抗氧化剂的线性范围为0-10.0mg/L，相关系数均大于0.995，检出限（LOD）为0.05-0.40mg/kg。在3种加标水平下的平均加标回收率为85.1%～98.5%，相对标准偏差为1.2%-5.3%（n＝6）。该方法准确、灵敏度高、重现性好，适用于加工肉制品中11种防腐剂和抗氧化剂的测定。关键词：二极管阵列高效液相色谱法；加工肉制品；防腐剂；抗氧化剂中图分类号：TS207.3

文献标识码：A

文章编号：1674-506X（2019）02-0085-0005

SimultaneousDeterminationof11PreservativesandAntioxidantsin

ProcessedMeatUsingHigh-performanceLiquidChromatographywith

DiodeArrayDetector

FUChun-hua，SHENLei，CHUHao，LIUXiao-mei，WUZe-jun*

（ZhuzhouInstituteforFoodandDrugControl，ZhuzhouHunsn412000，China）

Abstract：Toestablishahigh-performanceliquidchromatographywithdiodearraydetector（HPLC-DAD）methodseparatedwithgradientelutionforthedeterminationof11preservativesandantioxidantsinprocessedmeat，whichbasedonakindofpretreatmentmethodbysolid-phaseextractionforthedeterminationof

processedmeatwithcomplicatedmatrices.ThesampleswereseparatedonHPLC-DADsystemwithaXtimateC18columnanddetectedbyconvertingUV-Viswavelength，whichquantifiedbystandardcurvemethod.Themobilephasesweremethanoland0.02mol/Lammoniumacetateingradientelution.thecalibrationcurveswerelinearover

（3S/N）ofthismethodwere0.05-0.40mg/kg.Theaveragerecoveryratesof3concentrationlevelsinprocessed

theconcentrationrangeof0-10.0mg/Lwiththecorrelationcoefficientswereallabove0.995.Thedetectionlimitsmeatwerebetween85.1%and98.5%withtherelativestandarddeviationsofspikedsamplesvariedfrom1.2%toantisepticsandantioxidants．preservatives；antioxidants

5.3%（n＝6）.Themethodisaccurate，sensitiveandreproducible，andissuitableforthedeterminationof11Keywords：high-performanceliquidchromatographywithdiodearraydetector（HPLC-DAD）；processedmeat；doi：10.3969/j.issn.1674-506X.2019.02-017

收稿日期：2019-01-08

作者简介：符春花（1983-），女，湖南衡阳人，工程师，硕士。研究方向：食品质量安全分析。*通讯作者

86肉食具有丰富的营养成分，能供给人体优质蛋白质、脂肪、矿物质和维生素，是人类食用的重要食物来源。鲜肉经过腌制、风干、发酵、熏制或其他为增加香味或改善保存而处理过的肉类又称为加工肉制品［1］。加工肉制品中一般都含有油脂、蛋白等营养成分，在水分和适宜的温度条件下，容易滋生细菌，细菌的产生导致食品腐败、变质等。而防腐剂和抗氧化剂是食品中常见的添加剂，作用是抑菌杀菌、改善品质、改善口感及延长安全食用期限。防腐剂和抗氧化剂过量食用对人体健康会带来风险和危害，食品添加剂使用卫生标准GB2760-2014中明确规定了加工类肉制品中防腐剂和抗氧化剂的使用种类和限量标准，但加工肉制品中滥用食品添加剂的现象仍然存在［2］，因此，开发加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂是加强食品添加剂监管的有效途径，加工肉制品基质复杂且含高油脂、高蛋白，目前加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂的同时检测尚未见报道。本实验通过优化样品提取及净化方法、液相色谱分析条件等，建立了同时测定加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂的高效液相色谱分析方法。

目前，文献报道的检测防腐剂和抗氧化剂的方

法有液相色谱法（LC）［3］、气相色谱法（GC）［4］

、气相色谱-质谱联用色谱法（GC-MS）［5-7］、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［8-9］等。本方法建立固相萃取

方法进行样品前处理，DAD高效液相色谱同时进行防腐剂和抗氧化剂的定性定量方法，效果良好，节省检验时间，提高检验效率，能够满足日常检验要求。11.1

实验部分Waterse2695仪器与试剂

测器，美国Waters高效液相色谱仪：公司；HNS-SY-150配二极管阵列检

超声波清洗机：北京恒奥德科技有限公司；XSE204型电子分析天平（精确至0.00001g）：美国METTLERTOLEDO公司；ThermoST16R高速冷冻离心机。

对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸钾、苯甲酸的对照品：购自中国食品药品检定研究院；脱氢乙酸、纳他霉素、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚

2019年第2期（BHT）、叔丁基-4-羟基苯甲醚（BHA）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。试验用水为超纯水，甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯试剂；NaCl、H3（500mg，3mL；PO4Waters为分析纯试剂；公司）；所有溶液使用时均经C8固相萃取柱

0.451.2

μm色谱分析条件

微孔滤膜过滤。色谱柱：XtimateC18色谱柱（4.6mm×250mm，5溶液，μm）使用前过；流动相：0.45A为甲醇，μm滤膜；B为梯度洗脱，0.02mol/L乙酸铵

洗脱条件见表1。流速：1mL/min；波长程序：0.1-7.0min∶2249.5-24.0nm；7.0-8.134.2min∶min∶230nm；8.1-9.5min∶254nm；37.0minmin∶∶277256256nm；nmnm37.0-40.0；34.2-；24.0-28.2min35.2∶256minminnm∶∶；303290nm；28.2-40.0-55.0nm；35.3-292nm。进样量：10μL。

min∶

表1HPLC梯度洗脱条件

Tab.1MobilecompositionforHPLCgradientelution

时间/min流动相A013035体积分数/%

流动相B20802080802080362040374050604060208020801.3

准确称取标准溶液的配制

0.01g各种防腐剂及抗氧化剂标准

品，用色谱纯的甲醇稀释成各组份浓度为0.4g/L溶液，作为标准品储备液A；分别精密量取标准储备液0色谱纯甲醇稀释成浓度分别为、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，置于0100、2.0mL、4.0量瓶中，、6.0、8.0用、

10.01.4

mg/L样品前处理

的工作溶液。精密称取研磨粉碎样品2.00g，置50mL聚四氟乙烯具盖离心管中，加入10mL乙腈饱和的正己烷稀释样品，再加入10mL饱和氯化钠水溶液（用磷酸调pH至2-3），涡旋振荡2min，使样品充分分散均匀，然后再加入10mL正己烷饱和的乙腈超声20作进一步净化。

min，再以6000r/min速率离心5min，取乙腈层净化：取2mL乙腈提取液转入经5mL甲醇活化好的C8固相萃取柱中，用5mL乙腈-甲醇（2∶1，v/v）溶液洗脱并抽干C8固相萃取柱，将洗脱液收集

第55卷（总第210期）符春花等：高效液相色谱法同时测定加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂

87于10mL离心管中，45℃下用氮气吹至近干，用乙腈-甲醇（7∶3，v/v）溶解，涡旋混匀并定容至2mL，过0.45μm滤膜，滤液供HPLC测定。22.1

结果与讨论2.1.1方法前处理的确立

实验中大部分的防腐剂和抗氧化剂极性中等

提取溶剂的选择

偏强，属于有机弱酸。且在环境pH低于其本身pKa值2个单位时易于从水相萃取到有机相中，而且盐电离生成的离子能结合一层水分子，使溶液中自由水的浓度降低，从而提高目标分析物的浓度［8］。加工肉制品中含有较多的脂肪和蛋白质，在有机溶剂中容易聚集成团，待测物有可能被基质包裹，影响回收率，实验也证明当直接使用有机溶剂提取时，提取效率低；因此选用pH2-3的饱和氯化钠溶液稀释样品，大多数的蛋白质以及全部沉淀保留在水相中，从而去除杂质，使待测物更容易萃取到有机相中。

提取条件包括提取溶剂组成、流动相的种类与比例的选择、提取方式的选择、提取时间的选择等因素。目标分析物的提取效果取决于化合物的极性和样品基质的类型。本方法测定的防腐剂和抗氧化剂极性中等偏强，根据相似相溶的原理，采用极性较强溶剂进行提取。加工肉制品直接采用有机溶剂提取，其中含有的油脂和蛋白质等会被有机溶剂提取出来而带来干扰并污染色谱系统。因此实验选用正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂，乙腈对脂肪具有弱溶解性，采用乙腈饱和的正己烷液-液萃取净化。

2.1.2固相萃取净化净化方式的选择

（SPE）是用固态吸附净化液体样

品的前处理方法。SPE是一种以恒量富集、除杂、衍生、分离和纯化为目的的前处理方法，主要用于色谱和其他分析方法定量之前。加工肉制品基质较为复杂，且11种目标化合物的极性差别较大，采用液-液萃取并不能完全除去基质中的杂质，因此实验使用固相萃取净化（SPE），采用上样-洗脱的步骤处理防腐剂和抗氧化剂，使用固相萃取柱保留杂质，直接洗脱目标分析物以达到净化的效果。本方法采用固相萃取柱净化，并对净化效果进行了条件

试验，分别考察了C18、C8、NH3取柱，以观察固相萃取柱对11种防腐剂和抗氧化剂、中性氧化铝固相萃在加工肉制品中的净化效果。C18固相萃取柱对脱

氢乙酸的回收几乎为0，NH3山梨酸的回收较低，中性氧化铝固相萃取柱对部分固相萃取柱对苯甲酸、目标分析物的回收率较C18固相萃取柱低。结果表明在考察上述四种固相萃取柱的效果时，使用C8柱净化时11种目标分析物回收率均大于80%，结果满意。2.2

实验对流动相的种类和梯度洗脱条件、实验条件的优化

提取时间和提取方式等进行了考察。比较了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵作为流动相时各目标化合物的出峰情况。结果表明甲醇-水、乙腈-水作流动相时，多个目标化合物峰出现拖尾，加入乙酸铵后色谱峰峰形得到改善；流动相中乙酸铵浓度为0.02mol/L时多数化合物色谱峰响应值较高，峰形尖锐，最终选择甲醇-0.02mol/L乙酸铵作为流动相进行梯度洗脱。实验采用紫外-可见检测器变波长测定，考察了不同波长下测定情况，最终确定分段检测与3D检测相结合，选择每一个组分的最大紫外吸收波长作为检测波长，各组分总体响应均较好，基线稳定。

通过涡旋振荡与超声波提取相结合的方法，比较提取时间对回收率的影响，结果表明，涡旋振荡2饱和的乙腈超声min能够使样品充分分散均匀，20min对11种目标物质的提取效然后再加入正己烷果均比较理想。采用优化后的样品处理方法对加工肉制品进行测定，结果表明，去除油脂和蛋白、C8SPE品中各待测组分分离良好，小柱净化后得到的样品提取液非常干净，对样品中待测组分定量样无明显干扰，空白样品及0.02g/kg加标样品典型色谱图见图1。2.3

2.3.1方法学考察

对方法的线性范围、11种目标化合物质量浓度在回收率、精密度和检出限

0-10.0mg/L之

间的系列混合标准溶液进行测定，以目标组分的峰面积y对相应的质量浓度x（mg/L）绘制标准曲线，其相关系数（r）均不小于0.995。取加工肉制品作三个

882019年第2期0.005

0.000AU-0.005-0.010-0.015

0.00

5.0010.0015.0020.0025.0030.00时间/min

（a）加工肉制品空白样品色谱图

0.260.240.220.200.18AU0.160.140.120.100.080.060.040.020.000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.0055.0060.00时间/min

1.苯甲酸；2.脱氢乙酸；3.山梨酸；4.羟苯甲酯；5.BHA；6.羟苯乙酯；7.羟苯丙酯；8.纳他霉素；9.TBHQ；10.羟苯丁酯；11.BHT

（b）空白加工肉制品添加11种防腐剂和抗氧化剂的色谱图

12

8.5220.28

3422.939628.6557834.01034.8861038.60435.0040.0045.0050.0055.0060.006.5177.649528.005935.8931153.913图1

Fig.1

加工肉制品HPLC色谱图

Theliquidchromatographyofprocessedmeat

浓度水平的加标回收实验，每一浓度水平分别作6次平行测定，分别计算出方法的回收率和精密度，以3倍信噪比为检出限（LOD），其线性方程、相关系数和检出限见表2。结果显示各组分分离完全，线性良好，加标回收率为85.1%-98.5%，RSD为1.2%-5.3%，能够满足测定要求。3

结论

综上所述，本实验建立的一次性同时测定加工

液-液萃取方式提取，C8固相萃取技术进行提取净化以提高回收率并除去样品中的脂肪等杂质。各被测组分色谱分离良好，灵敏度高、回收率及精密度满足检验要求，结果准确，为加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂检测提供了技术支撑，对监测加工肉制品中食品添加剂使用情况具有重要的意义。参考文献

［1］夏丹乔，胡柯，张慧，等.肉和肉制品致癌风险的研究进

展［J］.教育教学论坛，2018（12）：114-116.

肉制品中11种防腐剂和抗氧化剂的方法，样品用

第55卷（总第210期）符春花等：高效液相色谱法同时测定加工肉制品中防腐剂和抗氧化剂

89表2方法的线性范围和测定低限

Tab.2Linearityrangeanddetectionlimits

待测物名称苯甲酸

线性回归方程y＝193313x－2364.7

相关系数/r20.99990.99890.99980.99980.99990.99980.99980.99990.99960.99640.9957

加标量/g·kg-10.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.050.010.020.05回收率/%87.290.292.591.290.693.492.495.597.190.792.594.488.691.395.489.790.492.690.491.995.391.094.398.587.092.195.985.688.990.685.189.792.4RSD/%，n＝62.81.62.43.73.12.43.73.12.43.53.21.54.53.92.45.35.14.04.13.43.63.73.01.84.93.51.94.83.72.15.24.42.5检出限/mg·kg－1

0.100.120.050.150.130.120.120.110.230.360.40

脱氢乙酸y＝284311x＋22522

山梨酸y＝593696x＋42290

纳他霉素y＝319100x－2966.7

羟苯甲酯y＝343433x－4986.9

羟苯乙酯y＝372759x－613.30

羟苯丙酯y＝275658x＋1643.1

羟苯丁酯y＝420532x－5155.0

BHABHTTBHQ

y＝76459x－15492

y＝13749x＋1985.5

y＝68551x－1497.1

［2］张柏瑀，赵颖，刘瑜，等.超高效液相色谱-串联四极杆-线性加速离子阱复合质谱法对加工肉制品中防腐剂、甜味剂的筛查检测［J］.中国卫生检验杂志，2017，27（15）：2155-2157.

［3］赵立峰，马国军.液相色谱法同时测定糕点中多种抗氧

化剂、防腐剂和甜味剂［J］.食品科学，2010，31（8）：［4］袁荷芳，朱振华，徐霞.气相色谱法测定食品中多种防

腐剂及抗氧化剂［J］.科技资讯，2012（33）：248.［5］李东刚，李春娟，刘敬东.GC-MS-SIM检测糕点中的防

腐剂和抗氧化剂［J］.分析仪器，2009（4）：56-60.230-232.

［6］姜晓辉.GC-MS法同时测定食品中的抗氧化剂和防腐

剂［J］.中国食品添加剂，2011（3）：229-233.

［7］陈安东，吴兆伟，余倩，等.GC/MS法同时分析液体制剂

及口服液型保健品中31种防腐剂和抗氧化剂［J］.质谱学报，2014，35（5）：438-446.

［8］凌云，储晓刚，张峰，等.超高效液相色谱-串联质谱法

同时测定调味料中的17种防腐剂和抗氧化剂［J］.色谱，2011，29（8）：723-730.

［9］张勋，刘韬，吴连鹏，等.高效液相色谱-串联质谱法测

定多种食品中7种酚类抗氧化剂和对羟基苯甲酸酯类防腐剂［J］.食品与发酵工业，2016，42（11）：206-211.